尿低分子量蛋白联合视网膜血管定量参数用于评估2型糖尿病微血管病变的临床价值研究

董海平 张高之 赵乐萍

1.浙江省乐清市人民医院内分泌科，浙江乐清325600；2.浙江省乐清市人民医院药剂科，浙江乐清325600

尿低分子量蛋白联合视网膜血管定量参数用于评估2型糖尿病微血管病变的临床价值研究

董海平1张高之1赵乐萍2

1.浙江省乐清市人民医院内分泌科，浙江乐清325600；2.浙江省乐清市人民医院药剂科，浙江乐清325600

目的探讨尿低分子量蛋白及视网膜血管定量参数用于评估2型糖尿病微血管病变的临床价值。方法将按标准纳入的患者分为2型糖尿病正常蛋白尿组、微量蛋白尿组和大量蛋白尿组与健康对照组，测α1-MG、β2-MG和TRF/Cr及视网膜血管定量参数CRAE、CRVE和Df。结果α1-MG、β2-MG和TRF/Cr三项检测指标各组各项检测指标和阳性率组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；CRAE、CRVE和Df各组各项检测指标组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论联合检测尿低分子量蛋白质α1-MG、β2-MG、TRF/Cr和视网膜血管定量参数，在诊断早期2型糖尿病患者微血管病变方面有显著意义，比尿微量蛋白更早提示2型糖尿病微血管病变的发生，通过联合检测上述指标，对2型糖尿病微血管病变的早期发现与提早干预可能具有重要的临床价值。

2型糖尿病微血管病变；评估；尿低分子量蛋白；视网膜血管定量参数

据WHO 2014年的最新统计，全球目前大约共有3.47亿糖尿病患者[1]，糖尿病已经成为全球人类第七大死亡原因。另有一项来自国际糖尿病联盟（IDF）的统计数据表明[2]，近10年内，中国糖尿病患者翻了近2倍，总人数已经达1.14亿，另外还有大约30%尚未得到诊断。目前中国已经超过印度，成为世界第一糖尿病大国。

2型糖尿病（T2DM）占糖尿病总发病率的9.4成以上，随着病程的进展，其胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌不足逐渐演变为胰岛素分泌不足为主伴胰岛素抵抗，期间多种慢性并发症开始出现，其中糖尿病肾脏损害、神经和各级血管病变是主要的慢性并发症，也是2型糖尿病预防与控制的重点和难点之所在。尿微量白蛋白（microalbuminuria，MAU）是指患者尿样中的MAU的浓度在（20~200）mg/L的亚临床范围内，它们是患者肾脏微循环受损的早期敏感指标，表明全身血管内皮广泛受损已经开始。国内外的多项研究[3-5]提示，MAU的发生与2型糖尿病患者糖尿病并发症的发生呈正相关且是一种较强的危险因子，同时也是治疗干预效果的优良评估指标。近年的研究表明[6-9]，尿中一些低分子量蛋白质，如尿α1微球蛋白（α1-MG）、β2微球蛋白（β2-MG）、尿转铁蛋白（TRF）和视网膜血管直径可能比尿微量白蛋白更早提示糖尿病患者糖尿病肾病及视网膜病变。尿低分子量蛋白及视网膜血管直径是否能比MAU更提早的提示2型糖尿病并发症的发生，一直是业界关注的问题。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择2013年3月～2014年9月间在我院内分泌科住院的明确诊断的2型糖尿病患者210例，糖尿病病程3～18个月，其中男112例，女98例，年龄46～77岁，平均（60.3±2.9）岁。采用酶免疫法测定患者24 h尿微量白蛋白（MAU）及免散瞳眼底照相检查，借助ImageJ软件分析图像，选择同一时期门诊70例，其中男40例，女30例，年龄45～79岁，平均（59.5±4.4）岁，为未患糖尿病及其他疾病的健康者，作为对照组进行比较。

1.2 诊断标准

2型糖尿病诊断标准：采用国际上通用的2002WHO糖尿病专家委员会提出的诊断标准，具体参照相关文献[10]。本研究采用早期糖尿病肾病诊断标准以检测24 h尿MAU定量[（30～300）mg/24 h]，低于30 mg/24 h为正常，＞300 mg/24 h为糖尿病肾病，辅以尿常规尿蛋白阳性为临床糖尿病肾病；糖尿病视网膜病变以2002年糖尿病性视网膜病变的国际临床分级标准为准则。

1.3 分组

24 h MAU＜30 mg/24 h者72例为第Ⅰ组（正常蛋白尿组），其中男38例，女34例，平均年龄（58.3±5.2）岁；30 mg≤24 h MAU≤300 mg者67例为第Ⅱ组（微量蛋白尿组），其中男36例，女31例，平均年龄（62.3± 6.4）岁；24 h MAU＞300 mg者71例为第Ⅲ组（大量蛋白尿组），其中男38例，女33例，平均年龄（61.1±5.9）岁；体检健康者70例为第Ⅳ组（对照组)，其中男37例，女33例，平均年龄（60.5±6.6）岁。

1.4 排除标准

①2型糖尿病病程虽短却出现大量蛋白尿、肾功能迅速恶化者；②1型糖尿病患者；③单纯肾源性血尿或不明原因蛋白尿伴血尿者；④其他疾病引起的蛋白尿；⑤近期有视力急剧减退而无明显常见病变者；⑥重度白内障者；⑦空腹血糖受损（IFG）和糖耐量异常（IGT）患者。

1.5 标本采集与检测

允许患者按惯例饮水、运动及摄入蛋白质，晨6时至次日晨6时留24 h尿，混合均匀，放入4℃冰箱内以待测，用迈瑞BS-800全自动生化析仪检测MAU和TRF，使用美国贝克曼库尔特IMMAGE800特种蛋白分析仪及配套专用试剂，采用全自动生化分析仪检测MAU和TRF；放射免疫速率散射比浊法检测α1-MG和β2-MG。

检测尿β2微球蛋白（β2-MG）和尿转铁蛋白（TRF），β2-MG参考值为（1～2.52）mg/L，单项检查结果超出参考值上限为阳性，为减少尿流率对检测结果产生的影响，210例样本同时采用酶法测定尿肌酐（Cr）做校正；选静脉早期正位、放大、清晰的图像，采用德国蔡司共焦激光眼底扫描计算机自动分析系统，在视网膜颞上、下动静脉向黄斑区的2～3个细小分支中，本研究统一选择测量第一个分支的血管直径，即分别精确测量视网膜颞上、下动静脉视盘边界外1个视乳头直径处的血管直径，测量由课题组3位同仁完成，每人测量3次取平均值。

1.6 统计学方法

应用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料中呈正态分布的数据以表示，呈非正态分布的实验数据以中位数表示，组间比较用非参数检验，以AUC判断各指标的诊断价值，相关分析采用Pearson’s或者Spearman’s试验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组各项检测指标结果与阳性率

2.1.1 各组各项检测指标比较各组各检测指标均为非正态分布，以中位数表示，经非参数检验分析，各组各项指标间的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.1.2 三项检测指标敏感性比较（除外对照组）尿α1-MG的AUC>尿β2-MG的AUC>尿TRF/Cr的AUC。见表2。

2.2 各组视网膜血管参数的对比与阳性率的分析

210例患者及70例对照组的视网膜血管定量参数包括视网膜中央动脉直径（central retinal arteriolar equivalent，CRAE）、视网膜中央静脉直径（central reti-nal venular equivalent，CRVE）和分形维数（fractal di mension，Df）均呈近似正态分布，CRAE均数为（133.7± 10.9）μm，CRVE的均数为（183.9.0±16.4）μm，Df均数为（1.354±0.061）μm。

表1 三组相关检测指标比较

表2 各检测指标AUC比较

各组各项检测指标间差异有统计学意义，在MUA正常的2型糖尿病组，CRAE、CRVE和Df与正常对照组的差异及不同病程进展的组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组视网膜血管参数比较

表3 各组视网膜血管参数比较

注：与第Ⅲ组（对照组）比较，*P＜0.05；与第Ⅰ组（正常蛋白尿组）比较，#P＜0.05；与第Ⅱ组（微量蛋白尿组）比较，☆P＜0.05

组别nCRAECRVEDf第Ⅰ组第Ⅱ组第Ⅲ组第Ⅳ组72 67 71 70 134.1±10.6*132.3±11.4#128.4±9.69☆136.2±10.5 182.6±17.4*180.4±18.2#177.0±15.6☆185.3±16.6 1.369±0.042*1.351±0.021#1.336±0.024☆1.388±0.0481

2.3 不同指标单独及联合使用检测阳性率分析

将70例健康对照组的平均值加两倍标准差确定为临界值，高于此则为阳性，以对照组检测结果加2倍标准差为临界值，高于此临界值判为阳性，各组各项检测指标间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

上表表明：在DN患者中，无论正常蛋白尿组、微量蛋白尿组还是大量蛋白尿组，α1-MG、β2-MG、TRF/Cr单项指标检测的阳性率均低于α1-MG、β2-MG、TRF/Cr与视网膜血管定量参数联合检测的阳性率，且同一组内α1-MG、β2-MG、TRF/Cr联合视网膜血管定量参数联合检测的阳性率组内无统计学差异（均P>0.05）。

3 讨论

糖尿病微血管病变在2型糖尿病的自然进程中，是危害最严重的并发症之一，其中的糖尿病肾病将逐渐由早期的微量白蛋白尿期逐渐进展到临床糖尿病肾病期，这时患者伴随大量白蛋白尿，而糖尿病视网膜病变的逐渐加重也最终将导致患者失明。在糖尿病微血管病变早期，即微量白蛋白尿期进行干预性治疗可逆转疾病进展，改善糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变患者的预后。如未能及早发现并实施有效的干预，2型糖尿病患者中20%将发展为终末期肾病，靠血液透析或肾移植维持生命。早期糖尿病肾病的筛选对延缓2型糖尿病的自然进程至关重要[11]。

本研究结果显示，210例早期2型糖尿病患者，无论是正常蛋白尿组、微量蛋白尿组还是大量蛋白尿组其血清α1-MG、β2-MG、TRF/Cr含量均显著高于正常对照组。

α1-MG为小分子蛋白，在肝细胞和淋巴细胞中被合成，分子量26～33 KD，等电PI=4.5～5.0，α1-MG在正常人群尿中含量甚微，仅血液中的游离型能自由通过肾小球滤过膜，但在正常人体中绝大部分在近曲小管被重新吸收并代谢，目前的研究表明[12-13]，肾功能恶化的程度与肾小管间质纤维化程度呈正关联，肾小管间质结构的损害程度情况在肾病的发展、预后和转归中起着决定性的作用，当肾小管受损时，在早期2型糖尿病患者尿微量蛋白正常组中，已经有65.3%的患者尿中α1-MG排泌增高，可见α1-MG是近曲小管损害的敏感指标，且其测定较少受尿液pH变动的影响，在肾脏疾病诊断方面具有重要价值。

β2-MG是低分子蛋白质，包括100个氨基酸残基，相对分子质量为11800 D，主要由肝脏合成，在健康人体内的生成和释放速度恒定，是细胞膜上组织相容性抗原的组成部分，也是细胞表面人类淋巴细胞抗原（HLA）轻链蛋白组分，属单链多肽低分子蛋白，能自由通过肾小球滤过膜，反映肾小管的重吸收功能，正常情况下，绝大部分的β2-MG在肾近曲小管在肾小管细胞的吞饮作用（pinocytosis）下进入胞浆，在胞浆内被溶酶体降解为氨基酸，极少量从尿中排出，肾脏是代谢β2-MG主要器官，倘若肾脏发生轻微病变，肾小管吸收功能下降，肾小球滤过膜上合成硫酸乙酰素会减少，肾小球滤过膜电荷选择屏障受损，β2-MG重吸收减少，则尿β2-MG浓度会升高，测定血和尿β2-MG能反映患者肾小球，肾小管的是否存在双重损伤，即只有在病理状态下，β2-MG才会升高，其中在肾小球早期损害中β2-MG可以显著升高，β2-MG是一种比血清肌酐、尿素氮更灵敏的反映肾损伤的指标[14]。

表4 各项指标单独及联合使用对DN患者早期糖尿病肾损伤的检出率比较[n（%）]

尿转铁蛋白是一种性质特殊性的单链糖蛋白，属球蛋白中的一种，直径约4 mm，分子量约77000，其蛋白质等电点（isoelectric point，PI）为5.6~6.6，生物半衰期为7～10 d，在肝脏内通过复杂的机理被合成，是一种具有高度敏感性的小分子循环内脏蛋白，类似于人体白蛋白，但是其所带负电荷和自身体积均远小于人体白蛋白，正常人体的肾小球带有大量负电荷，故绝大部分白蛋白和TRF均不能穿过肾小球滤过膜。对糖尿病肾病早期患者而言，一方面由于肾小球滤过膜上合成的带有大量负电荷的硫酸乙酰肝素及唾液酸量逐渐减少，与白蛋白和尿转铁蛋白之间的同性电荷排斥力减小，电荷屏障作用明显降低，带较少负电荷的尿转铁蛋白比尿白蛋白更容易渗漏出来，比白蛋白能更早的提示病变的发生；另一方面，糖尿病肾病早期，病变的肾小球毛细血管内皮细胞逐渐离开基底膜，相邻上皮细胞足突融合在一起，导致肾小球系膜区面积增加，与肾小球毛细血管失联的肾小球基底膜也出现孔径增大的病理改变，体积较白蛋白大的微量尿转铁蛋白的渗出，可以比白蛋白的升高更早说明肾小球体积选择屏障遭到破坏和损伤[15]。

本研究用尿肌酐（creatinine，Cre）作校正，检测早期2型糖尿病患者尿α1-MG、β2-MG和TRF/Cr水平，结果发现早期2型糖尿病患者尿α1-MG、β2-MG和TRF/Cr水平也有明显升高，表明α1-MG、β2-MG和TRF/Cr较其他指标更能敏感地反映早期2型糖尿病患者肾小球的损伤，可作为诊断早期2型糖尿病肾病早期损伤的灵敏指标。

Molnar等[16]的研究表明，早在2型糖尿病发生前2～3年，患者就已经出现视网膜小动脉狭窄，视网膜小动脉扩张是2型糖尿病微血管功能障碍的特殊征兆，反映了早期微血管的病变，这种功能性的病变在这个阶段通常是具有可逆性的，当高糖等危险因素得到有效控制后，这种病变会迅速改善。

血管直径是了解血流量的状况最可靠的依据，视网膜血流增大会使血管扩张，视网膜CRAE和CRVE增宽。Df是临床测定中相对稳定度非常好的数据，不受眼底照片分辨率、脉搏及血管数量的影响，主要数据依赖于分叉、分叉角度及分叉间血管长度等因素，多项研究[17、18]已经证实，2型糖尿病患者在普通眼底检查还观察不到视网膜病变时，其视网膜中央动脉、静脉、睫状后动脉就已经发生了血管形态学的改变，且血流速度及阻力指数也已发生了变化，本研究表明，在2型糖尿病患者出现MAU前的正常蛋白尿组CRAE、CRVE和Df就已经与健康人群的对照组存在显著性差异，并随着2型糖尿病病理过程逐渐加重，CRAE、CRVE和Df的改变加剧，各组间存在的差异具有统计学意义。我们的研究证实，视网膜血管定量参数或许有望成为2型糖尿病临床前期的标志。

联合检测尿低分子量蛋白质α1-MG、β2-MG、TRF/ Cr和视网膜血管定量参数，在诊断早期2型糖尿病患者微血管病变方面优于单项检测，整个检测过程操作方便、结果可靠、患者经济负担小，设备要求不高，但却能从肾小球、肾小管、肾功能改变和肾血流动力学改变等多方面监测肾脏病变，比尿微量蛋白更早提示肾小球基底病变的发生及肾小球滤过率的损害，可以明确提示肾脏损伤的程度和准确部位，为干预效果的检测提供可靠依据，通过联合检测上述指标，对预防2型糖尿病并发症的早期发现与提早干预可能具有重要的临床价值。

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Clinical value of urinary low molecular weight proteins combined with retinal vascular quantitative parameters in evaluation of type 2 diabetic microangiopathy

DONG Haiping1ZHANG Gaozhi1ZHAO Leping2

1.Department of Endocrinology,People's Hospital of Yueqing City in Zhejiang Province,Yueqing325600,China;
2.Department of Pharmacy,People's Hospital of Yueqing City in Zhejiang Province,Yueqing325600,China

ObjectiveTo probe into the clinical value of urinary low molecular weight proteins combined with retinal vascular quantitative parameters in evaluation of type 2 diabetic microangiopathy.MethodsThe included eligible patients were divided into the normal albuminuria group,the microalbuminuria group,the macroalbuminuria group according to their type 2 diabetic conditions and the healthy control group.α1-MG,β2-MG and TRF/Cr as well as retinal vascular quantitative parameters CRAE,CRVE and Df were determined in all groups.Results The differences in both detection indicators of α1-MG,β2-MG and TRF/Cr and the positive rate were statistically significant between different groups(P＜0.05);and the differences in detection indicators of CRAE,CRVE and Df were also statistically significant between different groups(P＜0.05).Conclusion The combination of urinary low molecular weight proteins α1-MG,β2-MG and TRF/Cr with retinal vascular quantitative parameters is of significant importance in the early diagnosis of microangiopathy in type 2 diabetic patients,which can earlier prompt the development of type 2 diabetic microangiopathy than microalbuminuria.The joint detection of above indicators may provide important clinical value in the early discovery and intervention of type 2 diabetic microangiopathy.

Type 2 diabetic microangiopathy;Evaluation;Urinary low molecular weight proteins;Retinal vascular quantitative parameters

R587.1

A

1673-9701（2015）18-0010-05

2015－02－14）

浙江省温州市第一期科技计划项目（Y20140214）；浙江省自然科学基金项目（LY12H07002）