荆肤止痒颗粒质量标准提高研究

刘和平柳 莹黄文漳曾德成 曹 晖彭招华

1.国家中药现代化工程技术研究中心袁广东珠海519020曰2.丽珠医药集团股份有限公司袁广东珠海519020

荆肤止痒颗粒质量标准提高研究

刘和平1,2柳 莹1,2黄文漳1,2曾德成2曹 晖1,2彭招华1,2

1.国家中药现代化工程技术研究中心袁广东珠海519020曰2.丽珠医药集团股份有限公司袁广东珠海519020

目的对荆肤止痒颗粒质量标准进行再提高研究。方法采用高效薄层色谱法(HPTLC)鉴别处方中君药荆芥曰采用高效液相色谱法(HPLC)测定臣药野菊花中蒙花苷的含量袁色谱条件院Agilent Zobrax SB-C18(250mm伊4.6mm袁5滋m)色谱柱袁以乙腈-2%冰醋酸水溶液(21颐79)为流动相袁柱温20益袁流速1.0mL/min袁检测波长334 nm。结果荆芥的供试品色谱与对照药材色谱在相应的位置上有相同的粉红色斑点袁阴性样品溶液无干扰斑点袁方法专属性强尧重复性好曰蒙花苷HPLC含量测定方法分离度好尧准确度高袁蒙花苷在15.26耀762.96 ng范围内呈良好的线性关系袁回归方程Y=12.7672X+17.254 18袁r=0.999 98袁定量限度为1.83 ng袁平均加样回收率为101.28%袁RSD为0.28%(n=9)。结论通过对君药荆芥和臣药野菊花的质量控制方法的建立和验证袁提高了荆肤止痒颗粒的质量标准袁能更好地监控该产品的质量。

荆肤止痒颗粒；蒙花苷；荆芥；含量；高效液相色谱；高效薄层色谱法

荆肤止痒颗粒(批准文号院国药准字Z10970119)由荆芥尧地肤子尧野菊花尧防风尧鱼腥草尧茯苓尧山楂7味中药及糊精等辅料制成的颗粒剂袁用于儿童风热型或湿热型丘疹性荨麻疹的治疗[1]。文献报道袁荆肤止痒颗粒对丘疹性荨麻疹湿热证和风热症的治疗效果均较好袁且临床用药安全[2-4]。本方以轻扬透散尧疏风止痒尧解毒透疹的荆芥和清热利湿尧祛风止痒的地肤子共为君药袁以清热解毒散风的野菊花和清热解毒除湿的鱼腥草以及散表祛邪尧散风止痒的防风共为臣药。故野菊花是本方主药之一袁为菊花科植物野菊花(Chrysanthemum indicum L.)干燥头状花序袁具有清热解毒尧凉肝明目的功效[5]。野菊花含有蒙花苷尧木犀草素尧金合欢素尧芹菜素尧异泽兰黄素等多种有效化学成分[6-8]袁蒙花苷是野菊花中重要的黄酮类化合物袁研究表明野菊花总黄酮及蒙花苷对葡萄牙假丝酵母具有明显的抗菌活性等多种作用[9]袁是本方的有效成分之一。目前已有报道对野菊花药材及其制剂中的单一或多种成分进行定量分析[10-12]袁均以高效液相色谱法(HPLC)进行测定。荆芥为方中君药袁文献报道[13-16]袁荆芥中除含挥发油袁还有橙皮苷尧荆芥苷尧木犀草素等黄酮类成分。原质量标准只建立了地肤子尧野菊花尧鱼腥草薄层色谱鉴别和防风中5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定袁缺乏荆肤止痒颗粒中主要功效成分君药荆芥的薄层鉴别和对具有明显抗菌活性作用的蒙花苷的含量测定。为了提高药品质量标准袁更全面地控制产品质量袁本研究在原质量标准的基础上袁增加了君药荆芥的薄层色谱鉴别和臣药野菊花中蒙花苷HPLC含量测定方法袁为荆肤止痒颗粒申报中药品种保护的质量标准提高提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备

自动点样仪LINOMAT 5(瑞士CAMAG)曰双槽展开缸曰MICROTEK Scan Maker 3830扫描仪曰Agilent 1260快速高效液相色谱仪(含G1311B四元泵尧G1329B自动控温自动进样器尧G4218A DAD检测器尧Chem station色谱数据处理工作站袁美国安捷伦)曰KQ-500VDE型双频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)曰CPA225D电子天平(德国赛多利斯)。

1.2 试剂与试药

硅胶G高效薄层板袁青岛海洋化工袁批号20100808曰甲醇(Merck色谱纯袁批号院1728707408)尧乙腈(Merck色谱纯袁批号院1730130410)袁乙酸乙酯(分析纯袁广州化学试剂厂袁批号院20101001-2)袁甲苯(分析纯袁广州化学试剂厂袁批号院20071204-2)袁甲酸(分析纯袁天津大茂化学试剂厂袁批号院111119-1)袁冰醋酸(分析纯袁广东光华化学厂有限公司袁批号院20100920)。水为自制超纯水袁香草醛(分析纯袁天津大茂化学试剂厂袁批号院20091201)。荆芥对照药材尧蒙花苷(Buddleoside)对照品购自中国药品生物制品检定所(批号院111528-201107)曰10批荆肤止痒颗粒(批号院1005002064尧1005012107尧1102001108尧0706006001尧0708008027尧0705004105尧0708007112尧0711009048尧0705003058尧0911012106)由丽珠医药集团四川光大制药有限公司生产和提供。

2 方法与结果

2.1 荆芥薄层色谱鉴别

2.1.1 供试品溶液制备取本品6 g袁研细袁加甲醇40mL袁超声提取20 min袁滤过袁滤液蒸干袁残渣加水20 mL使溶解袁转移至分液漏斗中袁用水饱和的乙酸乙酯萃取3次袁每次30 mL袁合并乙酸乙酯液袁蒸干袁残渣用甲醇溶解并转移至2 mL量瓶中袁加甲醇至刻度袁摇匀袁过微孔滤膜(0.45滋m袁确保带状点样的可操作性)袁取续滤液作为供试品溶液。

2.1.2 阴性溶液制备取缺少荆芥药材的阴性样品6 g袁按照供试品溶液制备方法制备荆芥阴性供试液。

2.1.3 对照药材溶液制备另取荆芥对照药材粉末1 g袁加甲醇20 mL袁超声提取20 min袁滤过袁滤液蒸干袁残渣用甲醇溶解并转移至2mL量瓶中袁加甲醇至刻度袁摇匀袁过微孔滤膜(0.45滋m)袁取续滤液作为对照药材溶液。

2.1.4 薄层色谱鉴别照薄层色谱法(叶中国药典曳2010年版一部附录遇B)袁分别吸取供试品溶液和对照药材溶液及荆芥阴性供试液各10滋L袁分别点于同一硅胶G高效薄层板上(条带状点样)袁以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5颐4颐1)为展开剂袁展开8 cm袁取出袁挥干袁喷以5%香草醛浓硫酸溶液袁在105益加热至斑点显色清晰袁置日光下检视。供试品色谱中袁在与对照药材色谱相应的位置上袁显相同的粉红色斑点袁在与荆芥阴性供试液色谱相应的位置上袁没有相同颜色的干扰斑点(图1)。

图1 荆芥薄层色谱鉴别图

2.2 野菊花中蒙花苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱院Agilent Zobrax SB-C18(250mm伊4.6mm袁5滋m)曰流动相院乙腈-2%冰醋酸水溶液(21颐79)曰柱温院20益曰流速院1.0mL/min曰进样量院10滋L袁DAD检测器袁检测波长院334 nm袁分离度不低于1.5袁理论塔板数以蒙花苷计不低于3000。

2.2.2 对照品溶液制备取蒙花苷对照品适量袁置于有P2O5的真空干燥器中减压干燥12 h袁精密称定袁加甲醇溶解(必要时加热)制成每1 mL含15滋g的溶液袁作为对照品溶液。

2.2.3 供试液制备取装量差异项下的本品袁研成细粉末过3号筛袁取0.5 g袁精密称定袁置于50 mL量瓶中袁加70%甲醇超声提取(功率500W袁频率45Hz)30min袁取出袁放至室温袁加70%甲醇至刻度袁摇匀袁滤过袁滤液过微孔滤膜(0.45滋m)袁取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 专属性考察取不含野菊花药材的阴性样品袁按野2.2.3冶项下方法制备野菊花阴性对照溶液袁吸取对照品溶液尧供试品溶液尧阴性对照溶液各10滋L袁分别注入色谱仪中袁按野2.2.1冶项下色谱条件测定。供试品在与对照品色谱相应的保留时间位置上袁有一相同的色谱峰袁而阴性对照溶液在此待测组分处无干扰的色谱峰袁结果表明方法的专属性良好(图2)。

图2 蒙花苷含测专属性考察色谱图

2.2.5 提取溶剂的选择取同一样品粉末(批号院1005002064)0.5 g袁平行3份袁分别用30%甲醇袁70%甲醇和甲醇提取溶剂袁按野2.2.3冶项下方法制备供试液袁测定并记录色谱图袁结果色谱图中蒙花苷峰面积分别为2311.33尧2673.48和2015.12袁表明70%甲醇的提取率最高袁故确定70%甲醇作为提取溶剂。

2.2.6 提取时间的选择取同一样品粉末(批号院1005002064)0.5 g袁平行3份袁分别采用超声15尧30尧 45min的方式袁按野2.2.3冶项下方法制备供试液袁测定并记录色谱图袁结果色谱图中蒙花苷峰面积分别为1683.38尧1788.92和1798.98袁表明超声30 min袁基本可以提取完全袁故提取方式选用超声30 min。

2.2.7 柱温比较精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁分别采用了不同柱温15尧20尧25尧30尧35益袁按照野2.2.1冶项下色谱方法测定并记录色谱图袁结果表明袁20益时色谱图的主要色谱峰分离度及响应值最佳袁故色谱柱温度选择20益。

2.2.8 流速比较精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁分别采用了0.8尧1.0尧1.2 mL/min的流速袁按照野2.2.1冶项下色谱方法测定并记录色谱图袁结果表明袁流速为1.0mL/min时色谱图的主要色谱峰分离度较佳袁故流动相的流速选择1.0mL/min。

2.2.9 色谱柱比较精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁分别采用不同品牌的色谱柱Discovery C18(250 mm伊4.6 mm袁5滋m)尧Diamonsil C18(250 mm伊4.6 mm袁5滋m)尧Zobrax C18(250 mm伊4.6 mm袁5滋m)袁按照野2.2.1冶项下色谱方法测定并记录色谱图袁结果表明袁Zobrax SB-C18(250 mm伊4.6 mm袁5滋m)色谱柱主要色谱峰分离度较佳。再精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁分别采用同一型号Zobrax SBC18(250 mm伊4.6 mm袁5滋m)不同批次的色谱柱(批号院B10207尧B11281尧B10126)袁按照野2.2.1冶项下色谱方法测定并记录色谱图袁实验结果不同批次色谱柱的蒙花苷色谱峰面积RSD约2%(n=6)袁表明袁所选用的同一型号Zobrax SB-C18(250mm伊4.6mm袁5滋m)不同批次的色谱柱重复性良好。

2.2.10 流动相耐受性精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁改变流动相比例依5%袁按照野2.2.1冶项下色谱方法测定并记录色谱图袁试验结果各色谱图中蒙花苷的分离度均达到1.5以上袁表明本方法的流动相耐受性良好。

2.2.11 线性关系考察分别精密吸取浓度为15.26滋g/mL的对照品溶液1尧2尧4尧6尧10尧15滋L袁以及浓度为76.296滋g/mL的对照品溶液5尧10滋L袁注入液相色谱仪中袁按照野2.2.1冶项下色谱条件测定。以对照品绝对量为横坐标X袁峰面积为纵坐标Y袁绘制标准曲线袁得到线性方程Y=12.7672X+17.254 18袁r=0.999 98。结果表明袁蒙花苷在15.26耀762.96 ng范围内袁呈良好的线性关系。将浓度为15.26滋g/mL的对照品溶液稀释25倍袁按照野2.2.1冶项下色谱条件进样3滋L袁测定袁得到的色谱峰峰高约为基线的10倍袁对照品相对应的量1.83 ng袁即定量限度为1.83 ng。

2.2.12 仪器精密度精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁按照野2.2.1冶项下色谱条件连续进样6次袁测定袁蒙花苷色谱峰面积的RSD值为0.24%(n=6)袁结果表明仪器精密度良好。

2.2.13 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(批号院1005002064)袁按照野2.2.1冶项下色谱条件分别在第0尧1尧3尧6尧12尧24尧48 h不同的时间点测定袁蒙花苷色谱峰的面积RSD值为0.44%(n=7)袁结果表明供试品溶液在48 h内基本稳定。

2.2.14 重复性试验取同一样品(批号院1005002064)粉末袁平行6份袁按野2.2.3冶项下方法制备样品溶液袁野2.2.1冶项下色谱条件进行测定袁结果蒙花苷平均含量为0.149%袁RSD值为0.84%(n=6)袁表明本法重复性良好。

2.2.15 准确度试验取已知蒙花苷含量的同一样品(批号院1005002064)粉末袁平行9份袁以80%尧100%尧120%三个水平分别加样袁按野2.2.3冶项下方法制备样品溶液袁野2.2.1冶项下色谱条件进行测定袁每组蒙花苷加样平均回收率在95%耀105%之间袁RSD均约1%(n= 9)袁结果表明本方法准确度良好(表1)。

表1 蒙花苷含量测定准确度试验结果(n=9)

2.2.16 样品测定取10批荆肤止痒颗粒样品粉末袁按野2.2.3冶项下方法制备供试品溶液袁野2.2.1冶项下色谱条件进行测定袁结果见表2。

表2 荆肤止痒颗粒蒙花苷含量测定结果(n=3)

根据样品测定数据袁考虑本品生产的实际情况袁暂定本品每袋含野菊花以蒙花苷(C28H32O14)计算不得少于1.0mg。

3 讨论

3.1 检测指标的选择

荆肤止痒颗粒(批准文号院国药准字Z10970119)为丽珠医药集团股份有限公司的独家品种袁已上市多年袁产生了较大的经济效益袁为了申报中药品种保护袁需要在原质量标准的基础上袁开展质量标准提高研究。荆芥为方中君药袁主要含挥发油尧橙皮苷尧荆芥苷尧木犀草素等成分。原标准中没有荆芥的鉴别袁曾分别对荆芥的挥发性成分和橙皮苷的鉴别进行了条件摸索袁但均无法排除阴性干扰袁故建立了以荆芥对照药材为参照的薄层色谱鉴别方法。野菊花为方中的臣药袁处方用药量大袁所含的蒙花苷为本品主要抗菌类成分之一袁叶中国药典曳2010年版一部野菊花含量测定是以蒙花苷为含测指标袁所以本实验建立了蒙花苷含量测定方法。新建立的荆芥薄层鉴别和蒙花苷含量测定方法袁操作简便尧结果可靠尧重复性好袁使原质量标准得到提高袁为荆肤止痒颗粒申报中药品种保护提供技术支持。

3.2 薄层鉴别项

在文献研究的基础上袁本实验曾摸索了展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5颐3颐1颐1)尧甲苯-吡啶-甲酸(36颐9颐5)尧甲苯-甲醇-乙酸(35颐5颐5)尧甲苯-三氯甲烷-丙酮(40颐25颐35)尧甲苯-甲醇-丁酮(60颐20颐20)尧甲苯-吡啶-甲酸(36颐9颐5)尧甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5颐4颐1)袁结果黄酮类成分薄层色谱经典展开剂甲苯-乙酸乙酯-甲酸系统的分离效果最好。比较了不同的显色剂5%的三氯化铝乙醇溶液尧10%的硫酸乙醇溶液尧5%的香草醛浓硫酸溶液袁结果目标成分在香草醛浓硫酸溶液下显粉红色斑点袁故选择5%的香草醛浓硫酸溶液作为显色剂。比较了不同生产厂家的高效薄层板和普通薄层板袁结果德国Merck公司生产的普通硅胶G薄层板和高效硅胶G薄层板的分离度均符合要求袁青岛海洋化工厂生产的高效硅胶G薄层板的分离度符合要求袁但其普通硅胶G薄层板的分离度达不到要求袁不能使用。薄层色谱鉴别采用瑞士CAMAG公司的自动点样仪进行条带状点样袁为了确保带状点样的可操作性袁点样前需要将供试品溶液过0.45滋m微孔滤膜。条带状点样量为10滋L袁如果采用手动点状点样袁点5滋L即可。点样后将薄层板放置于有五氧化二磷的真空干燥器中袁减压干燥1 h后再展开袁以控制薄层板的湿度袁达到较好的分离效果。

3.3 含量测定项

采用HPLC法测定蒙花苷的含量袁参照文献报道[13-17]袁曾比较了流动相乙腈-0.1%磷酸(25颐75)尧乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱尧甲醇-0.1%磷酸(55颐45)尧乙腈(A)-0.1%磷酸(B)水溶液梯度洗脱尧乙腈-1.0%醋酸水溶液梯度洗脱尧甲醇-水-冰醋酸(52颐46颐2)袁结果乙腈-2%冰醋酸水溶液(21颐79)为流动相的分离效果最佳袁且阴性无干扰。蒙花苷为黄酮类成分袁在紫外区有明显吸收袁根据叶中国药典曳2010年版一部野野菊花冶含量测定项下以及蒙花苷的光谱图袁选择确定检测波长为334 nm。

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Study of im proving quality standard on Jingfuzhiyang Granules

LIU Heping1,2LIU Ying1,2HUANGWenzhang1,2ZENG Decheng2CAO Hui1,2PENG Zhaohua1,2
1.National Engineering Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Province, Zhuhai 519020,China;2.Livzon Pharmaceutical Group Inc.,Guangdong Province,Zhuhai 519020,China

Ob jective To improve quality standards of Jingfuzhiyang Granules.M ethods High performance thin layer chromatography(HPTLC)was used to identify Schizonepetae Herba thatwasmonarch drug in Jingfuzhiyang Granules, and high performance liquid chromatography(HPLC)was used to determine the content of buddleoside in Chrysanthemi Indici Flos thatwasministerial drug.Chromatographic conditions:Agilent Zobrax SB-C18(250mm伊4.6mm,5滋m),mo鄄bile phase:acetonitrile-2%acetic acid water(21颐79),column temperature:20益,flow speech:1.0mL/min,detective wave鄄length:334 nm.Resu lts The test product and the reference drug chromatographic had the pink color of the spots in the corresponding position,but the negative sample excepted.So the HPTLC had good specificity and repeatability.The resolution of HPLC was qualified,which had high accuracy.Buddleoside had a good linearity in the range of 15.26-762.96 ng,and the regression equation was Y=12.7672X+17.254 18(r=0.999 98).The average recoverywas 101.28% and RSD was0.28%(n=9).Conclusion Through theestablishmentand validation ofquality controlmethod of Schizonepetae Herba and Chrysanthemi Indici Flos respectively,the quality standard on Jingfuzhiyang Granules has been improved to monitor the quality of the products better.

Jingfuzhiyang Granules;Buddleoside;Schizonepetae Herba;Assay;High performance liquid chromatog鄄raphy;High performance thin layer chromatography

R28

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0105-05

院2015-01-05本文编辑院张瑜杰)

彭招华(1964-)袁女袁广东珠海人袁高级工程师袁主要从事中药新药开发与研究。