重组人神经生长因子治疗大鼠糖尿病周围神经病变的效果

白 羊 章永垒 黄奋飞 陈胜亮 阮 卡 陈 星▲

未名生物医药有限公司，福建厦门361009

重组人神经生长因子治疗大鼠糖尿病周围神经病变的效果

白 羊 章永垒 黄奋飞 陈胜亮 阮 卡 陈 星▲

未名生物医药有限公司，福建厦门361009

目的观察重组人神经生长因子（rhNGF）治疗大鼠糖尿病周围神经病变（DPN）效果。方法选用健康成年的雄性SD大鼠，腹腔注射链脲霉素（STZ）建立糖尿病（DM）大鼠模型。1个月后检测大鼠尾部感觉神经传导速度（SNCV），以SNCV＜30m/s为DPN成模标准。将DPN大鼠随机分为6组，分别为模型对照组、受试药rhNGFⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（剂量分别为0.3、1、3、9μg/kg）4个剂量组，阳性对照组（依帕司他15mg/kg），同时设正常对照组。连续给药2个月，检测大鼠体重、血糖、大鼠尾部SNCV、坐骨神经传导速度（MNCV）以及坐骨神经中果糖及山梨醇含量。结果DM造模1个月后，模型对照组大鼠体重、血糖值、尾部SNCV和坐骨神经MNCV均与正常对照组有明显差异（P＜0.01），表明DPN造模成功。受试药rhNGF对DPN大鼠体重和血糖值无显著影响（P＞0.05），对大鼠尾部SNCV和坐骨神经MNCV具有明显改善作用，给药2个月rhNGF受试组（Ⅲ）大鼠尾部SNCV、rhNGF受试组（Ⅱ、Ⅲ）坐骨神经MNCV较模型对照组高且差异有统计学意义（P＜0.05）。DPN大鼠坐骨神经中果糖及山梨醇的含量显著升高，说明DPN的发生与多元醇代谢紊乱具有相关性。受试药rhNGF能降低DPN大鼠坐骨神经中果糖及山梨醇的含量，其中果糖含量变化具有一定的剂量相关性，而山梨醇含量变化未发现明显的剂量效应。结论受试药rhNGF对DPN大鼠神经具有较好的保护作用，与阳性对照药依帕司他作用相似，可能与改善DPN大鼠的多元醇代谢相关。

糖尿病；糖尿病周围神经病变；神经生长因子；神经传导速度；山梨醇；果糖

糖尿病（diabetesmellitus，DM）是常见的代谢性疾病，据估计我国约有11.6%的成人患有DM［1］。糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是DM最常见的慢性并发症之一［2］。应用外源性神经生长因子（nerve growth factor，NGF）有助于DPN症状减轻［3］，临床上可有效地改善DPN的神经症状、血清蛋白含量和血液流变学［4-8］。但目前国内使用的NGF主要来源为天然提纯，与天然NGF相比，重组人神经生长因子（recombinanthumannervegrowth factor，rhNGF）具有易获得、高产率、高活性与低成本等特点［9］。本文对DPN大鼠给予rhNGF治疗，对治疗前后体重、血糖值、大鼠尾部感觉神经传导速度（sensory nerve con duction velocity，SNCV）和坐骨神经运动神经传导速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）以及大鼠坐骨神经中果糖、山梨醇含量进行了比较，对rhNGF对大鼠DPN的治疗效果进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

体重200～250 g的健康雄性SPF级SD大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供（动物质量合格证号：44002100003545）。rhNGF（未名生物医药有限公司，批号：BW 101），采用E.coli重组表达［10］，HPLC检测纯度＞98.0%，TF-1细胞法检测体外生物学活性＞500 AU/μg。

1.2 仪器与试剂

T1000Y电子天平（美国双杰兄弟公司）、BS211D型电子天平（德国Sartorius公司）、BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）、罗氏卓越血糖仪（罗氏诊断产品有限公司）、GC2010 plus气相色谱仪（岛津企业管理有限公司）、DMT-2500多管涡混合仪（杭州米欧仪器有限公司）、TGL20MW离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、NDK200-2氮吹仪（杭州米欧仪器有限公司）、悬转蒸发仪（上海申生科技有限公司）、T18D10G匀浆机（德国IKA有限公司）。

链脲霉素，Sigma-Aldrich公司，批号：WXBB2432V；水合氯醛，天津科密欧化学试剂有限公司，批号：20130325；甲醇，色谱纯，Honeywell，批号：NAAG3H；三氟乙酸，分析纯，上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：E1421021；吡啶，色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：J1329001；N，N-二甲基乙酰胺，色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司，批号：C1425015；乙酸酐，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20141211；山梨醇对照品，Sigma-Aldrich公司，批号：MKBM0921V；果糖对照品，中国药品生物制品检定研究院，批号：100231-201305。

表1 给药方案

1.3 方法

1.3.1 造模方法

选用健康成年的SD大鼠158只，体重200～250 g，腹腔注射链脲霉素（STZ 60 mg/kg），1周后测定血糖，以血糖≥16.7mmol/L作为DM成模标准，DM模型成功后大鼠出现多饮多食、多尿、体重增长缓慢或体重减轻的症状。待DM模型建立1个月后，检测大鼠尾部SNCV，以＜30 m/s为DPN大鼠成模标准。

1.3.2 分组及给药方案

1.3.2.1 动物分组选取DPN造模成功的90只大鼠随机分为6组（n=15），分别为模型对照组、受试药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（rhNGF剂量分别为0.3、1、3、9μg/kg）4个剂量组，阳性对照组，同时设正常对照组。

1.3.2.2 给药途径①受试药组：按上述剂量肌内注射给药，给药体积1mL；②正常对照组、模型对照组：给予受试药组等体积的0.9%氯化钠注射液，肌内注射给药；③阳性药对照组：依帕司他（15 mg/kg），灌胃给药，给药体积10 mL。给药频率及周期：每天1次，连续给药2个月，具体见给药方案见表1。

1.3.3 体重及血糖检测

每周检测大鼠体重；给药后每月测试动物血糖。

1.3.4 大鼠尾部SNCV检测

给药后每月检测1次大鼠尾部SNCV。大鼠用10%水合氯醛麻醉后俯卧位固定，清洁大鼠尾部皮肤，电极放置方式为一对刺激电极（负极位于正极近心侧）插入大鼠尾部皮下，然后依次插入记录电极Ⅰ和记录电极Ⅱ，记录电极Ⅰ在刺激电极负极近心侧2 cm处，记录电极Ⅱ在记录电极I近心侧2 cm处，再将参考电极Ⅰ、Ⅱ分别插入距记录电极Ⅰ、Ⅱ近心侧0.5 cm处皮下，最后将接地电极插入刺激电极负极与记录电极Ⅰ之间。采用BL420F型多道生理信号处理系统测定各组大鼠尾部SNCV，重复刺激3次，间隔30 s，取平均值。尾部SNCV（m/s）=记录两电极之间的距离/动作电位潜伏期时间差［6］。

1.3.5 坐骨神经MNCV检测

末次给药检测SNCV后，检测MNCV（m/s）。将大鼠俯卧位固定，分离右侧坐骨神经约20 mm，用两对并列固定的勾式刺激电极（双极保护电极）置于坐骨神经上，分为中枢端和外周端，两对电极之间的距离为15 mm，于腓肠肌处用一对针式电极插到腓肠肌上记录诱发的复合动作电位（两电极之间距离约为8mm）。用单脉冲方波刺激，波宽0.1ms，自动增量刺激诱发产生复合动作电位。计算两对刺激电极之间的距离（D），测量两点传导所需要的时间（T2-T1）。MNCV=D/（T2-T1）［11］。

1.3.6 坐骨神经果糖及山梨醇的含量

取大鼠左侧坐骨神经，用纯水冲洗，称重，按照1根坐骨神经加1mL纯水后匀浆，4℃下2000 r/min离心10 min，取得即匀浆上清液。取混合标准品溶液20μL（果糖3 mg/m L、山梨醇2 mg/mL），在80℃金属浴中氮气吹干，加入400μL匀浆上清液复溶后，加入100μL 10%三氟乙酸溶液，在12 000 r/min下离心10 min，取上清液300μL，在80℃水浴中减压蒸干，依次加入0.5mL吡啶、0.5mLN，N-二甲基乙酰胺，1mL乙酸酐，混匀后在90℃水浴中反应40min，过0.45μm滤膜后注入气相色谱仪检测。气相色谱条件：毛细管柱：Rtx-5（0.25 mm×30 mm；膜厚0.25μm）；载气：氮气；流速：0.4 mL/min；程序升温150℃（保留2 min），5℃/min升温至250℃，再以10℃/min升温至290℃（保留9min）；气化室温度：280℃；检测器：氢火焰检测器；进样量1μL［12］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、血糖水平比较

DM造模大鼠体重均低于正常对照组且差异有高度统计学意义（P＜0.01），血糖值均大于16mmol/L，高于正常对照组且差异有高度统计学意义（P＜0.01），表明DM造模成功。连续给药2个月DPN大鼠体重、血糖均保持稳定，与模型对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠给药前后血糖水平比较（mmol/L，x±s）

2.2 大鼠尾部SNCV、坐骨神经MNCV

DM大鼠造模1个月后，模型对照组及各给药组大鼠尾部SNCV（均＜30 m/s）低于正常对照组且差异有高度统计学意义（P＜0.01），表明DPN造模成功。给药过程中，模型对照组大鼠尾部SNCV随时间延长而逐步降低，提示在没有药物干预情况下，大鼠DPN症状加重。rhNGF各受试组、阳性对照组大鼠尾部SNCV和坐骨神经MNCV均较模型对照组高，其中给药1个月rhNGF受试组（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）与阳性对照组大鼠尾部SNCV较模型对照组高且差异有统计学意义（P＜0.05）；给药2个月rhNGF受试组（Ⅲ）与阳性对照组大鼠尾部SNCV较模型对照组高且差异有统计学意义（P＜0.05）；给药2个月rhNGF受试组（Ⅱ、Ⅲ）与阳性对照组坐骨神经MNCV较模型对照组高且差异有统计学意义（P＜0.05）；其他各组均有提高但差异无统计学意义（P＞0.05）。说明rhNGF与阳性药物均对DPN大鼠尾部SNCV、坐骨神经MNCV均有较好的改善作用。见表3。

表3 各组大鼠给药前后SNCV、坐骨神经MNCV比较（m/s，±s）

表3 各组大鼠给药前后SNCV、坐骨神经MNCV比较（m/s，±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；SNCV：感觉神经传导速度；MNCV：运动神经传导速度

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2.3 大鼠坐骨神经中果糖及山梨醇含量

给药对大鼠坐骨神经中果糖及山梨醇含量的影响模型对照组大鼠坐骨神经中果糖、山梨醇的含量均高于正常对照组且差异有高度统计学意义（P＜0.01）。给药2个月后，rhNGF受试组（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）和阳性对照组果糖含量低于模型对照组且差异有统计学意义（P＜0.05）；rhNGF受试组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）和阳性对照组山梨醇含量低于模型对照组且差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠给药后坐骨神经中果糖及山梨醇含量比较（μg/mg，±s）

表4 各组大鼠给药后坐骨神经中果糖及山梨醇含量比较（μg/mg，±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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3 讨论

DPN是DM主要的慢性并发症之一，其发病率与DM病程有关，有60%～90%的患者通过神经功能检查，均有不同程度的神经病变［2,13］。DPN发病率高，受累神经广泛，临床症状尤其是疼痛持续时间长，严重影响DM患者的生活质量，甚至造成严重生活障碍，是医学上急需解决的问题［14］。

DPN的发病机制尚未完全阐明，多数学者认为该病发生是多种因素共同作用的结果。其中多元醇-肌醇途径学说认为多元醇代谢通路的增强，果糖、山梨醇在神经组织细胞内大量蓄积是DPN的重要发病机制之一［16-17］。研究表明，DPN时神经组织内果糖及山梨醇含量升高，主要与神经细胞外葡萄糖浓度增高有关［18］，使用醛糖还原酶抑制剂（ARI）如依帕司他能阻止山梨醇的沉积，也能阻止神经组织内肌醇的减少，从而改善神经传导速度［19-22］。因此，本研究选择依帕司他作为阳性对照药，并选择DM大鼠造模成功1个月后大鼠尾部SNCV＜30m/s的DPN造模成功的大鼠进行试验。

本研究结果表明，模型对照组大鼠体重、血糖值、尾部SNCV和坐骨神经MNCV均与正常对照组有明显差异（P＜0.01），表明DPN造模成功。受试药rhNGF对DPN大鼠的体重和血糖值无明显影响，对DPN大鼠尾部SNCV和坐骨神经MNCV等周围神经症状具有明显的改善作用（剂量3μg/kg疗效最佳）。DPN大鼠坐骨神经中果糖及山梨醇的含量显著升高，说明DPN的发生与多元醇代谢紊乱具有相关性。受试药rhNGF能降低DPN大鼠坐骨神经中果糖及山梨醇的含量，其中果糖含量变化具有一定的剂量相关性，而山梨醇含量变化未发现明显的剂量效应。受试药rhNGF与阳性对照药依帕司他对大鼠DPN的作用机制类似，与改善DPN大鼠的多元醇代谢相关。

［1］Xu Y，Wang L，He J，et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults［J］.JAMA，2013，310（9）：948-959.

［2］施君，张文川.糖尿病周围神经病变发病机制的研究进展［J］.上海交通大学学报：医学版，2012，32（1）：116-119.

［3］柳川.糖尿病周围神经病与神经生长因子［J］.国外医学：药学分册，1998，25（4）：224-227.

［4］王建法，陈清汉.神经生长因子与尼莫地平对糖尿病周围神经病变预处理的影响［J］.中华实验外科杂志，2015，32（1）：139-141.

［5］沈巍.鼠神经生长因子、丹红注射液联合治疗对糖尿病周围神经病变患者血液流变学，神经传导速度的改善效果［J］.中国老年学杂志，2013，33（12）：2749-2750.

［6］卫重娟，程焱，梁浩，等.神经生长因子对糖尿病神经病变大鼠神经肽和神经传导速度的影响［J］.中华神经医学杂志，2013，12（8）：779-782.

［7］韩红，李燕.鼠神经生长因子对糖尿病周围神经病变患者神经传导速度和血清IGF-1的影响［J］.中国实用医刊，2014，41（20）：85-87.

［8］黄昭瑄，尹秀英，黄昭穗，等.外源性神经生长因子对糖尿病周围神经病变的疗效观察［J］.临床军医杂志，2010，28（4）：573.

［9］徐莉，饶春明.神经生长因子的研究进展［J］.中国生物制品学杂志，2014，27（1）：131-134.

［10］未名生物工程有限公司.一种目的蛋白制备方法及其用途［P］.CN201210467001.8

［11］穆晓红，刘铜华，秦灵灵，等.从血液流变学和坐骨神经传导速度评价中药糖痹康对大鼠糖尿病周围神经病变的影响［J］.中华中医药杂志，2012，27（2）：378-381.

［12］封卫毅，侯家玉，王晶，等.甲钴胺，格列齐特及其联合用药对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经功能和多元醇代谢通路的影响［J］.中国药学杂志，2004，39（1）：27-30.

［13］Li G，Sun C，Wang Y，et al.A Clinical and Neuropathological study of Chinese patients with diabetic peripheral neuropathy［J］.PloSOne，2014，9（3）：e91772.

［14］Vinik AI，Shapiro DY，Rauschkolb C，et al.A randomized withdrawal，placebo-controlled study evaluating the efficacy and tolerability of tapentadol extended release in patientswith chronic painful diabetic peripheral neuropathy［J］.Diabetes Care，2014，37（8）：2302-2309.

［15］Stavniichuk R，Shevalye H，Hirooka H，et al.Interplay of sorbitol pathway of glucose metabolism，12/15-lipoxygenase，and mitogen-activated protein kinases in the pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy［J］.Biochemical Pharmacology，2012，83（7）：932-940.

［16］Van Dam PS，Cotter MA，Bravenboer B，et al.Pathogenesis of diabetic neuropathy：focus on neurovascularmechanisms［J］.European journal of Pharmacology，2013，719（1）：180-186.

［17］Sima A，Zhang W.Mechanisms of diabetic neuropathy：axon dysfunction［J］.Handbook of Clinical Neurology，2013，126：429-442.

［18］Snedecor SJ，Sudharshan L，Cappelleri JC，et al.Systematic review and reta-analysis of pharmacological therapies for painful diabetic peripheral neuropathy［J］.Pain Practice，2014，14（2）：167-184.

［19］贾全心.依帕司他治疗糖尿病周围神经病变疗效观察［J］.中国医药，2012，7（z1）：79-80.

［20］邬磊，刘鹏鹰.依帕司他治疗糖尿病周围神经病变大鼠的疗效评价［J］.实用临床医药杂志，2013，17（13）：4-8.

［21］Hotta N，Akanuma Y，KawamoriR，et al.Long-term clinical effects of Epalrestat，an aldose reductase inhibitor，on diabetic peripheral neuropathy：the 3-year，multicenter，comparative aldose reductase inhibitor-diabetes complications trial［J］.Diabetes Care，2006，29（7）：1538-1544.

［22］郑海燕，程长明.依帕司他片联合甲钴胺穴位注射治疗糖尿病周围神经病变［J］.中国医药，2012，7（12）：1608.

Therapeutic effect of recombinant human nerve grow th factor on rats w ith diabetic peripheral neuropathy

BAIYang ZHANG Yonglei HUANG Fenfei CHEN Shengliang RUAN Ka CHEN Xing▲
SinoBioway Biomedicine Co.,Ltd.,Fujian Province,Xiamen 361009,China

Ob jective To observe the therapeutic effect of recombinant human nerve growth factor(rhNGF)on diabetic peripheral neuropathy(DPN)rats.Methods Healthy adultmale SD rats were induced to diabetes rats by intramuscular injection of streptozotocin.After amonth,rats with the tail sensory nerve conduction velocity(SNCV)＜30 m/s were confirmed as DPN model rats.DPN ratswere random ly divided into six groups,including themodel control group,the investigational drug rhNGFⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ(doses of 0.3,1,3,9μg/kg)4 dose groups and the positive control group (epalrestat 15mg/kg),concomitantly with the normal control group.During the administration of 2 months,body weight of ratswere detected weekly,blood glucose and SNCV monthly,sciatic nerve conduction velocity(MNCV)was detected after the last administration,and levels of sorbitol and fructose in sciatic nerve were last measured.Resu lts Body weight,blood glucose,SNCV and MNCV of themodel control group were significantly different with the normal control group after amonth(P＜0.01),showed that the successfulmodeling of DPN.The investigated drug rhNGF and the positive drug epalrestat had no significant effect on body weight and blood glucose of DPN rats(P＞0.05),but improved SNCV and MNCV.At 2 month,SNCV in rhNGF group(Ⅲ)and MNCV in rhNGF group(Ⅱ,Ⅲ)were significantly higher than themodel control group(P＜0.05).Levels of fructose and sorbitol in sciatic nerve raised in DPN rats,indicated the relationship between DPN and polyolmetabolism.rhNGF reduced fructose and sorbitol in sciatic nerve,with dose effect in fructose but not in sorbitol.Conclusion rhNGF has a significant protective effect on nerve of DPN rats, whichmay be associated with improvement of polyolmetabolism similar with epalrestat.

Diabetes mellitus;Diabetic peripheral neuropathy;Recombinant human nerve growth factor; Nerve conduction velocity;Sorbitol;Fructose

R745

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0004-05

2015-03-23本文编辑：任念）

国家“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX09 401-017）。

▲通讯作者