P4对双氧水诱导SH-SY 5Y细胞凋亡的保护作用

金鑫，阴育红，马婷

1.黑龙江佳木斯市中心医院神经内二科，黑龙江佳木斯 154000；2.黑龙江省佳木斯市中心医院神经内一科，黑龙江佳木斯 154000

P4对双氧水诱导SH-SY 5Y细胞凋亡的保护作用

金鑫1，阴育红1，马婷2

1.黑龙江佳木斯市中心医院神经内二科，黑龙江佳木斯 154000；2.黑龙江省佳木斯市中心医院神经内一科，黑龙江佳木斯 154000

目的研究P4对双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法体外培养SH-SY5Y细胞，建立双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的模型，给予P4进行干预。应用Hoechst染色，测定细胞凋亡率。结果10uM的双氧水24 h可以使SH-SY5Y细胞凋亡率达到（56.33±13.17）%。然而，给予P4后，SH-SY5Y细胞的凋亡率明显减低,P4加双氧水组与双氧水组对比差异有统计学意义（P<0.05）。结论P4对SH-SY5Y细胞的凋亡有保护作用。

P4；双氧水；SH-SY5Y细胞；Hoechst33258染色

氧化应激长期以来被认为是中枢神经系统退行性疾病(如阿尔茨海默病)神经元损伤的一个主要因素。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤[1-3]。活性氧自由基包括超氧阴离子（·O2-）、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等。过氧化氢（H2O2），作为主要的活性氧，可以改变细胞的细胞内氧化还原状态，诱导氧化损伤其转化成高反应性的羟基自由基。此外，过氧化氢和羟基自由基导致线粒体的结构和功能的损伤，引起细胞凋亡。因此，过氧化氢已经被广泛使用在中枢神经系统的神经毒性和神经保护作用的氧化应激细胞培养模型中[4]。SH-SY5Y是一种分化程度较低的肿瘤细胞，显示中水平的多巴胺-β-羟基酶活性，细胞形态、生理及生化功能与正常神经细胞相似，并具有明显的轴突[5]。有研究表明，P4不仅用于生殖系统，而且对中枢神经系统也有保护作用[6]。该实验主要研究P4对SH-SY5Y细胞的保护作用及机制，为临床治疗中枢神经系统退行性疾病提供实验数据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3—10月期间培养的SH-SY5Y细胞作为实验样本，把分化1周的SH-SY5Y细胞分为对照组（什么都不加），双氧水组（只加10 uM双氧水），BDNF+双氧水组，DMSO预处理液+双氧水组，DMSO预处理液+Y1036+双氧水组,P4预处理液+双氧水组，P4预处理液+Y1036+双氧水组。24 h后除对照组之外，其余都加入10uM双氧水，放入CO2培养箱中。24h后用Hoechst33258染色，测定细胞凋亡率。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法 细胞培养液（250 mL）：DMEM/F12培养基225mL活性炭吸附的小牛血清或小牛血清37.5mL青霉素/链霉素2.5mL。

用含有FBS的培养液培养SH-SY5Y细胞24 h。24 h后，用PBS洗2次，用0.5mL胰蛋白酶快速洗1遍，在放入1mL胰蛋白酶，放入CO2培养箱中5Min。然后加入5 mL含有FBS的培养液，将细胞充分混匀后进行数细胞。用含C.S.FBS培养液和维甲酸以5×104/ML的密度将细胞铺到12孔板中，分化1周。

将DMSO和10 nMP4加入到C6细胞中，处理24 h。然后提取上清液做为预处理溶液。

1.2.2 双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的处理方法 应用Hoechst染色，测定细胞凋亡率。按5×104/mL的密度将细胞铺到6孔板中。分为3组：正常对照组，不加双氧水；加入5 uM的双氧水；加入10 uM的双氧水。每组2个孔。24 h后，用Hoechst33258染色，测定细胞凋亡率。

1.2.3 P4对SH-SY5Y细胞凋亡的处理方法 把分化1周12孔板的SH-SY5Y细胞分为对照组（什么都不加），双氧水组（只加10uM双氧水），BDNF+双氧水组，DMSO预处理液+双氧水组，DMSO预处理液+Y1036+双氧水组,P4预处理液+双氧水组，P4预处理液+Y1p036+双氧水组。将加入BDNF，DMSO预处理液，DMSO预处理液+Y1036，P4预处理液，P4预处理液+Y1036的细胞放入CO2培养箱中。24 h后除对照组之外，其余都加入10uM双氧水，放入CO2培养箱中。24 h后用Hoechst33258染色，测定细胞凋亡率。

1.3 统计方法

该次研究相关数据采用Graphad PrisM5统计学软件处理，计数资料采用χ2检验，计量资料采用F检验。

2 结果

2.1 双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡的浓度

正常对照组细胞呈椭圆或梭形，轴突明显。随着，双氧水浓度增高，细胞损伤也随之加重，胞膜破裂，细胞核固缩、凝聚和碎裂，见图1。采用5uM的双氧水处理SH-SY5Y细胞24 h后，凋亡率与正常对照组差异无统计学意义（P=0.6257>0.05）；用10 uM的双氧水处理SH-SY5Y细胞24 h，凋亡率达到（56.33±13.17）%,与正常对照组差异有统计学意义（CF=5.950,P=0.0377<0.05），见图2：图中*符号表示响应的两组差异有统计学意义。所以，10 uM的双氧水是诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最佳浓度。

图1 不同浓度双氧水对SH-SY5Y细胞形态的影响

2.2 P4对SH-SY5Y细胞的保护作用

用10uM的双氧水处理SH-SY5Y细胞24h后，经Hoechst33258荧光染色，发现有亮蓝色的典型凋亡细胞。加入P4-CM组凋亡细胞明显减少，但是P4-CM+Y1036组凋亡的细胞有所增加，双氧水组与P4-CM组差异有统计学意义（χ2=0.774 5，F=8.01 4,P=0.000 7<0.05，见图3：*，@，#分别表示具有统计学意义的对照组），双氧水组与P4+Y1036+双氧水差异无统计学意义（P=0.082 5>0.05）。所以，P4对双氧水诱导SH-SY5Y细胞凋亡有保护作用，且是通过增加BDNF释放来起到保护作用的。

图2 不同浓度双氧水对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

图3 不同组合下SH-SY5Y细胞的保护作用的统计分析

3 讨论

中枢神经系统退行性疾病一直被认为是顽固而难治的“三不”（病因不明，疗效不好，预后不良）性疾病。研究证明，神经细胞死亡的形式有：凋亡，坏死，自身吞噬，细胞质增生。过氧化氢（H2O2）是体内氧化代谢的中间产物，属于非自由基活性氧，易穿透细胞膜，与细胞内的还原型铁离子通过Fenton反应生成高度毒性的羟自由基，对多种细胞（特别是脑组织神经元细胞）造成毒性，引起细胞死亡[7-9]。所以，本研究以H2O2作用于体外培养的SH-SY5Y细胞，造成氧化损伤模型[10]。

本实验首先应用Hoechst33258荧光染色对H2O2诱导SH-SY5Y细胞的浓度进行检测，结果表明，10uMH2O2处理细胞24 h后，凋亡率达到（58.33±13.17）%，5 uM的双氧水处理细胞24 h后，凋亡率与正常对照组无统计学差异。所以选用10 uMH2O2诱导SH-SY5Y细胞凋亡[11-12]。给予H2O2之前，分别加入BDNF，DMSO预处理液，DMSO预处理液+Y1036，P4预处理液，P4预处理液+ Y1036。结果表明加入P4预处理液的细胞比加入DMSO预处理液的细胞，凋亡率明显减少。加入Y1036组比没加Y1036组细胞凋亡率有所增加。该实验证明，P4通过增加BDNF的释放对H2O2诱导SH-SY5Y细胞凋亡起到保护作用。下一步研究P4对小鼠海马损伤是否有保护作用，该研究可能有益于中枢神经系统退行性疾病的治疗。

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The Protection of P4 on Hydrogen Peroxide Induced Apoptosis in SH-SY5Y Cells

JIN Xin1,YIN Yu-hong1,MATing2
1.Second Department of Neurology,JiamusiCentral Hospital,Jiamusi,Heilongjiang Province,154002 China；2.First Department of Neurology,Jiamusi Central Hospital,Jiamusi,Heilongjiang Province,154002 China

ObjectiveTo study the effects of P4 on hydrogen peroxide induced apoptosis in SH-SY5Y cells.MethodsModel of hydrogen peroxide induced apoptosis in SH-SY5Y cellswhich were cultured in vitro was built,for the intervention for which,P4 was used.The ratio of apoptosis determined by hoechst staining.ResultsApoptosis rate of SH-SY5Y cell was 56.33%±13.17% under 10uMhydrogen peroxide in 24 hours.However,after giving P4,SH-SY5Y cell apoptosis rate was significantly reduced. Therewere statistically significant differences between P4 plus hydrogen peroxide and hydrogen peroxide group(P<0.05).ConclusionP4 on apoptosis of SH-SY5Y cells have Aprotective effect.

P4;H2O2;SH-SY5Y cells;Hoechst33258 staining

R74

A

1674-0742（2015）06（b）－0045-03

2015-03-10）

金鑫（1979-），女，黑龙江佳木斯人,硕士，主治医师，主要从事缺血性脑卒中的神经保护作用机制方面的研究工作。

阴育红（1971-），女，山东肥城人，硕士，主治医师，主要从事神经内科工作。邮箱：xinjin620@163.com。