RNA-seq技术鉴定Bt水稻对拟环纹豹蛛肠道基因表达的影响

王 娟，梁运姗，王 智

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

RNA-seq技术鉴定Bt水稻对拟环纹豹蛛肠道基因表达的影响

王 娟，梁运姗，王 智

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

为了探究Bt水稻对拟环纹豹蛛体内基因表达水平的影响，利用Illumina 2000测序平台对蜘蛛肠道进行转录组测序并分析其基因表达情况，从分子角度揭示Bt水稻的生物安全性。对肠道测序共获得65 028 186条clean reads，经Trinity软件拼接得到135 829 条长度大于200 bp的Unigene用于整个转录组分析。用FPKM法计算2个样本中基因的表达量，并以负二项分布检验法分析其显著性。结果显示，富集Bt的拟环纹豹蛛体内相对于正常蜘蛛显著差异表达的基因有142个，包括1个下调141个上调，并且其差异表达倍数都在8倍以上（FDR＜0.05，Log2Ration＞2）。利用Blast程序将差异基因与COG, GO和KEGG数据库进行比对，对差异基因进行功能注释。注释结果描述的酶、生物学过程和代谢途径与细胞内产能反应相关，如细胞色素c氧化酶，氧化磷酸化等。推测Cry1Ab 可能对拟环纹豹蛛体内能量代谢相关基因的表达有一定的影响。

Cry1Ab蛋白；拟环纹豹蛛；肠道；转录组

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在我国的农业生产中占有举足轻重的地位[1]。同时，水稻也是我国虫害问题最为严重的作物之一，科学解决水稻虫害问题对于提高水稻产量十分重要。近年来，转Bt基因抗虫水稻（Bt水稻）的出现为缓解水稻虫害问题提供了新的方向，它能够特异性杀死靶标生物鳞翅目和鞘翅目等害虫，减少杀虫剂的使用，提高水稻产量。研究表明Bt水稻中的Bt毒蛋白可以沿着食物链传递，并在植食者和捕食者体内发生一定程度的富集，这样，水稻田中的非靶标生物也可能受到Bt毒蛋白的影响[2]。此时，评估稻田中非靶标节肢动物的安全性成为Bt水稻安全性评估必不可少的一部分内容。一方面，对Bt水稻田中节肢动物群落进行长达2 a的调查统计显示，Bt蛋白对稻田中植食类、寄生类、捕食类和腐食类动物的群落主要参数（物种丰富度，均匀性指数，优势集中性指数）、功能团优势度和功能团内科组成及其优势基本无显著的负面影响[3]。另一方面，从节肢动物个体上看，不同节肢动物对Bt蛋白的耐受性不一样，受到的影响也不一样，如转Cry1C和Cry12A基因水稻不会影响植食者白背飞虱若虫的发育历期、存活率、雌虫的体重以及成虫的产卵量和卵孵化率[4]，而稻田优势种拟环纹豹蛛的发育历期在Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的作用下会显著延长，且体内部分保护酶谷胱甘肽过氧化物酶和乙酰胆碱酯酶也会受到一定影响[5-6]。然而，这些研究大都是从宏观层面出发，反应Bt水稻对非靶标生物的影响，没有从分子层面评估Bt水稻的安全性。因此，为了更全面的评估Bt水稻的安全性，利用转录组测序技术分析非靶标生物拟环纹豹蛛在Bt蛋白作用下肠道基因的表达情况，以期为Bt水稻的安全性评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试转基因水稻和虫源

转Cry1Ab基因水稻汕优63和对照组普通汕优63水稻种子由湖南师范大学生命科学学院提供。供试水稻种植在湖南农业大学生物科学技术学院的独立的天台上。供试期间人工管理并不施用任何农药，并分为Bt试验组水稻和对照组水稻，均使用尼龙网圈围（3 m × 2 m × 1 m）。试验期间两组水稻分别培养，互不干扰。稻飞虱采自湖南省农业科学院常规实验水稻田，未施用农药。采集稻飞虱成虫带回尼龙网水稻品种上饲养，分为试验组和对照组，建立实验种群。收集取食水稻15 d的褐飞虱作为拟环纹豹蛛的食物[7]。

1.2 供试蜘蛛

从湖南省农业科学院常规实验水稻田中（未施用农药）采集的大小均一的拟环纹豹蛛成蛛饲养在玻璃指管中，玻璃指管中放入一小团湿润的棉球以提供蜘蛛所需水源，每只蜘蛛每天喂食20只褐飞虱。待蜘蛛捕食飞虱3、6、9、12 d后取出蜘蛛测量Cry1Ab蛋白在蜘蛛体内的富集量，取Cry1Ab蛋白最大富集量下的拟环纹豹蛛作转录组测序。

1.3 ELISA 检测

所有待测蜘蛛匀浆后加入适量PBS缓冲液，12 000 r/min离心2 min，取上清液作为待测样品备用。Cry1Ab蛋白含量测定采用Bt-Cry1Ab/Ac ELISA平板试剂盒（PathoScreen, 美国Agdia公司），根据说明进行Cry1Ab含量测定。所有结果均由酶标仪读取，在波长450 nm下测定OD值，重复3次。设置Cry1Ab蛋白标准曲线浓度为2、4、8、16和24 ng/L。

1.4 转录组测序

总共有40只拟环纹豹蛛用于解剖肠道，为防止RNA降解所有解剖均在冰面上进行。解剖出的肠道用液氮速冻后加Trizol保存于-80℃冰箱中。所有样品均送至上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组测序。

1.5 数据分析

ELISA检测的数据由SPSS17.0软件进行显著性分析，采用单因素显著性分析方法，P＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同天数下拟环纹豹蛛体内Cry1Ab蛋白含量

如图1所示，Cry1Ab蛋白含量在拟环纹豹蛛体内是一种动态变化的状态，其富集量从第三天的0.091 ng/g到第六天上升至0.13 8 ng/g，并且在第九天时达到最大富集量0.396 ng/g，然后又在第12天时下降到0.267 ng/g。这表明，Cry1Ab蛋白可以沿着食物链从水稻通过褐飞虱传递到拟环纹豹蛛体内并在一定程度上富集。

图1 Cry1Ab蛋白在拟环纹豹蛛体内变化规律

2.2 拟环纹豹蛛肠道转录组测序分析

2.2.1序列拼接采用测序平台Illumina 2000 对拟环纹豹蛛肠道转录组进行测序，总共获得65 028 186条clean reads，包含了6487 679 770个核苷酸序列信息。对所获得的cleans reads 去冗余后用Trinity 软件对reads进行逐步拼接，最终得到Unigene。如表1所示，经过de novo 拼接，总共得到135 829 条长度大于200 bp的Unigene，42 133条大于500 bp Unigene，19 217条大于1 000 bp的Unigene。此外，所有Unigene 的总长度为80 907 174 bp，平均长度为595.65 bp，N50值为874 bp。

2.2.2基因表达分析为了研究Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛肠道基因表达水平的影响，用拼接得到的所有Unigene做库，以FPKM法计算基因在各样品中的表达量，然后采用DEGseq软件包中的负二项分布检验计算基因差异表达量，并采用NB（负二项分布检验的方式）对reads数进行差异显著性检验。以FDR＜0.05，Log2ratio ＞2 为筛选标准筛选富集Cry1Ab蛋白的蜘蛛相对于正常蜘蛛显著差异表达的基因。结果显示，富集Cry1Ab蛋白拟环纹豹蛛的肠道基因中共有142个基因相对于正常组蜘蛛显著差异表达，包括1个上调基因，141个下调基因。此外，所有显著差异表达的基因均有较大幅度的表达水平变化，都在8～14倍之间。这表明，Cry1Ab的摄入对拟环纹豹蛛体内某些基因的表达有较大的影响。

2.2.3差异基因功能注释将筛选得到的差异表达基因利用Blast程序比对到COG，GO和KEGG 数据库中，取匹配值最高的比对结果作为该基因的功能预测结果。142个差异表达基因中有30个差异基因在COG数据库中有比对结果。这30个基因分别注释到COG数据库的16个子分类中，包括细胞色素c氧化酶，组蛋白，脂肪酸去饱和酶，阿尔法晶状体蛋白等（表2）。据统计，COG注释结果中细胞色素c氧化酶这一条目被较多的差异基因注释到，被注释的基因中有31%的差异基因的生物学功能是编码细胞色素c氧化酶的，它们分别编码细胞色素c氧化酶的一些亚基，包括亚基I、亚基II及相关蛋白、亚基III及相关蛋白。众所周知，细胞色素c氧化酶是线粒体上电子传递末端的酶，对细胞内氧化还原反应具有重要的调控作用，本研究中试验组拟环纹豹蛛体内编码细胞色素c氧化酶的基因异常表达表明，Cry1Ab蛋白可能对蜘蛛肠道细胞内氧化还原反应有一定影响。

表2 差异表达基因COG注释结果分类

对差异表达基因进行GO注释，结果显示有34个显著差异表达基因比对到GO数据库的3个本体中。类似于COG注释结果，有20.6%的差异基因的生物功能是跟发生在线粒体上的氧化还原反应相关的，共涉及12种生物学过程，如电子传递链、线粒体内膜、呼吸链、氧化磷酸化、电子载体活性、有氧呼吸和细胞色素c氧化酶活性等（表3）。这些注释结果进一步表明，Cry1Ab蛋白可能影响拟环纹豹蛛体内线粒体上的一些氧化还原反应。

此外，所有差异表达基因的KEGG注释结果显示，共有11个差异基因注释到21条不同的代谢途径中，而氧化磷酸化代谢途径（ko00190）是被差异基因注释到最多的代谢途径，占所有被注释的基因的23.8%。众所周知，氧化磷酸化是生物体内重要的能量传递反应，它在真核生物线粒体内通过氧化还原反应产生ATP为其他生理活动提供能量。调控氧化磷酸化代谢途径的相关基因异常表达表明，Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛肠道细胞内线粒体的生物学功能有影响，即影响到线粒体的产能功能。

表3 差异表达基因GO注释结果中与线粒体相关的生物学功能

3 结论与讨论

Bt水稻作为一种新型的抗虫水稻，它可以使Bt蛋白特异性作用在鳞翅目昆虫的肠道上，破坏细胞膜的完整性，引起细胞渗透失衡，细胞膨胀并溶解，最终导致昆虫死亡[8]。而拟环纹豹蛛作为稻田蜘蛛优势种，性情凶猛，个体较大，捕食性强，同样对控制水稻田中害虫种群数量有着十分重要的作用[9]，虽然是非靶标生物，但Bt蛋白仍可能对拟环纹豹蛛产生不利影响。因此，研究利用高通量测序技术分析对拟环纹豹蛛在Bt蛋白作用下的基因表达情况进行分析，从分子层面揭示Bt水稻的安全性。

在研究中，通过Illunian2000测序平台对蜘蛛肠道进行测序获得65 028 186条clean reads，再经Trinity软件de novo 拼接获得135 829 条长度大于200 bp的Unigene用于后续分析。整个测序过程中获得了超过6 G的数据量，是小菜蛾中肠转录组测序数据量的6倍[10]，相当于亚洲卷叶螟整只转录组序列的1.3倍[11]，该次测序为拟环纹豹蛛肠道转录组研究提供了足够的原始数据。

为了探究Cry1Ab 蛋白是否会影响拟环纹豹蛛肠道某些重要基因的表达水平，重点分析了富集Cry1Ab蛋白的拟环纹豹蛛相对于正常蜘蛛显著差异表达的基因（FDR＜0.05，Log2Ration＞2）。共筛选得到142个显著差异表达的基因，包括一个1下调，141个上调，所有差异基因的表达水平相对于正常水平都有8倍以上的变化，这意味着Cry1Ab蛋白会对拟环纹豹蛛体内某些基因的表达产生较大的影响。基于相似性比对的原理，对差异表达基因进行功能注释，分别于COG、GO和KEGG数据库中进行比对（E value＜10-5），选择匹配最好的一项作为注释差异基因的注释信息。

研究结果显示，差异基因中有30个基因在COG数据库中有比对结果，34个在GO数据库中有比对结果，11个在KEGG 数据库中有比对结果。其中，COG注释结果显示差异基因中有部分差异基因是编码细胞色素c氧化酶的。细胞色素c氧化酶是细胞内电子传递重要的末端调控酶，其相关基因的异常表达会影响到细胞内某些氧化还原反应。据此推断，Cry1Ab蛋白对拟环纹豹蛛肠道细胞内线粒体上的氧化还原反应有不利影响。此外，将差异基因比对到KEGG数据库中，在被注释到的21条代谢通路中，氧化磷酸化代谢途径是差异基因参与调控最多的代谢途径。这从另一方面表明，Cry1Ab蛋白会影响到拟环纹豹蛛体内线粒体的生物学功能，并且可能是通过影响线粒体上的产能反应来阻碍线粒体功能的。除此之外，还有一些差异基因在KEGG注释被认为参与调控某些次级产物代谢途径，包括甘油磷酸酯代谢、醚脂代谢、花生四烯酸代谢等。曾有研究显示，当比较正常小菜蛾与抗Bt蛋白小菜蛾中肠基因的表达情况时，小菜蛾体内差异表达基因的生物学功能在氧化还原酶活性这方面有富集，并且同样有大量的基因参与调控某些次级代谢反应[10]。因此，在拟环纹豹蛛体内，大量差异基因编码细胞色素c氧化酶，参与线粒体相关的生物学过程，调控氧化磷酸化代谢途径，这些都可能跟蜘蛛对Cry1Ab毒蛋白的防御机制相关。

转录组测序技术可以直观的反应出生物体在某一状态下基因的表达情况[12]，研究首次利用该技术分析了Cry1Ab蛋白作用下拟环纹豹蛛肠道基因的表达情况，从全新的角度评估了Bt水稻对非靶标生物拟环纹豹蛛的生物安全性。

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[11] Xu L N, Wang Y Q, Wang Z Y, et al. Transcriptome differences between Cry1Ab resistant and susceptible strains of Asian corn borer[J]. BMC Genomics 2015, 16(1): 173.

[12] 祁云霞，刘永斌，荣威恒. 转录组研究新技术：RNA-Seq及其应用[J].遗传，2011，33（11）：1191-1202.

（责任编辑：高国赋）

Effect of Bt Rice on Intestinal Gene Expressing of Pardosa pseudoannulata by RNA-seq Identification

WANG Juan，LING Yun-shan，WANG Zhi
（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

In order to test the effect of Bt rice on the gene expression profle of wolf spider Pardosa pseudoannulata, the transcriptome of spider intestine was sequenced via Illunina 2000 sequencing platform and the gene expression was analyzed to reveal the safety of Bt rice at molecular level. In this study, all 65 028 186 clean reads were obtained from the sequencing, all 135 829 Unigene (＞200bp) were assembled by using Trinity software, and FPKM was utilized to quantify gene expression level in two samples and negative binomial distribution test was employed to analyze the significance. The results indicated that total 142 differential expression genes (DEGs) were detectable in Bt-containing spider as compared with non-Bt spider, including 1 down-regulated gene and 141 up-regulated genes. Besides, the change of all DEGs was higher than 8 folds (FDR＜0.05, Log2Ration＞2). To understand the biological function of DEGs, all DEGs were contrasted with COG, GO and KEGG databases with Blast program, the enzymes, biological processes and metabolism pathways described in the annotation results were involved in intracellular energy reaction, including cytochrome c oxidase, and oxidative phosphorylation pathway, implying Cry1Ab might have impacts on the expression level of genes related to energy metabolism inPardosa pseudoannulata.

Cry1Ab protein;Pardosa pseudoannulata; intestine; transcriptome

S636.2

：A

：1006-060X（2015）09-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.09.001

2015-08-02

国家自然科学基金（31071943，31272339）；湖南省教育厅科学研究基金（10A054）

王 娟（1990- ），女，湖南岳阳市人，硕士研究生，研究方向为发育生物学。

梁运姗，王 智