养心通脉有效部位方对MSCs移植大鼠急性梗死心肌影响的研究*

李勇华，郑景辉，袁肇凯

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆万州 404120；2.广西中医药大学附属瑞康医院科研科，广西南宁 530011；3.湖南中医药大学中医诊断学国家重点学科，湖南长沙 410007)

论著·基础研究

养心通脉有效部位方对MSCs移植大鼠急性梗死心肌影响的研究*

李勇华1，郑景辉2，袁肇凯3

(1.重庆三峡医药高等专科学校，重庆万州 404120；2.广西中医药大学附属瑞康医院科研科，广西南宁 530011；3.湖南中医药大学中医诊断学国家重点学科，湖南长沙 410007)

目的 探讨养心通脉有效部位方(apr-YTF)对急性梗死心肌实施骨髓间充质干细胞(MSCs)移植促修复的影响。方法将造模成功的AMI大鼠分为模型对照组、空白对照组、阳性对照组[重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)]和实验观察组(apr-YTF)，分别给予MSCs以及相应药物心肌注射，PcLab生物医学信号采集处理系统测定在体心功能，免疫组织化学检测缝隙连接蛋白43(Cx43)，RT-PCR检测心脏早期发育基因NKx2.5。结果实验观察组动物的心功能恢复最好；心肌细胞Cx43阳性着色颗粒呈分散样改变，主要分布于端端连接的闰盘区域和侧侧连接的胞膜上，实验观察组的IOD值最高；各组NKx2.5均有一定水平的表达，实验观察组表达最强，而模型对照组则只有极弱的表达。结论apr-YTF能促进MSCs移植修复急性梗死心肌，改善心功能。

干细胞；心肌梗死；养心通脉；心脏早期发育基因

养心通脉有效部位方(active principle region of YangxinTongmai Formula，apr-YTF)是由秦伯未先生治疗胸痹心痛的有效名方研制而成，研究表明具有良好的抗急性心肌缺血作用[1]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植能改善急性缺血心肌功能，其研究已成为心脑血管疾病领域的热点[2-3]。apr-YTF能促进MSCs归巢于急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的心肌组织[4-5]。那么，apr-YTF对急性梗死心肌实施MSCs移植促修复的影响值得进一步研究，为将来的心肌梗死新药研发打下基础，现将探讨实验报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 (130±20)g的清洁级雄性SD大鼠取MSCs，选用同品系同来源(240±20)g的SD雄性大鼠进行AMI造模，均购自湖南中医药大学动物实验中心。

1.1.2 试剂 由中南大学药学院按照课题组稳定的制作工艺制作提供apr-YTF；于北京博奥森生物技术有限公司购买缝隙连接蛋白43(Cx43)兔源性多克隆抗体；于北京中杉金桥生物技术有限公司购买兔抗大鼠SP免疫组织化学染色试剂盒和DAB免疫组织化学显色试剂盒；于美国Invitrogen公司购买Trizol；于加拿大Fermentas公司购买逆转录聚合酶链反应试剂盒；于Invitrogen公司购买聚合酶链反应(PCR)引物。

1.1.3 引物 在NCBIGenbank公布的引物序列，使用Primer Premier 5.0进行设计心脏早期发育基因NKx2.5的引物，由Invitrogen公司合成，见表1。

表1 PCR引物序列及扩增目的片段大小

1.1.4 仪器 使用北京微信斯达科技发展有限责任公司生产的PcLab生物医学信号采集处理系统；美国Bio-Rad公司生产的PCR基因扩增仪；英国UVI公司生产的凝胶图像处理系统和数字彩色显微图像系统7001×UVI；美国Image-Pro Plus图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MSCs细胞悬液配制 课题组按照成熟的技术[6]，先从SD雄性大鼠胫骨和股骨骨髓中分离、培养并鉴定MSCs，然后用胰蛋白酶消化后离心，进一步计数，再以无血清的DMEM培养基配制，使细胞悬液浓度为3×106/100 μL，4 ℃保存备用。

1.2.2 AMI模型制备 取健康清洁级雄性SD大鼠，按10 mL/kg于腹腔注射3%水合氯醛进行麻醉，背位固定后将气管分离暴露， 3～4气管软骨间刺破后插入20号钝圆穿刺针头，并以微型人工呼吸机连接进行正压呼吸。纵行切开胸部正中线旁约0.5 cm处，逐层分离后剪破3～4肋间之肌层，以自制小拉钩从双侧拉开暴露心脏，剪开心包膜，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2 mm处以6/0号丝线穿过，将左冠状动脉前降支结扎。心电图的记录采用PcLab生物医学信号采集处理系统，出现肢体导联R波振幅明显升高，随后I导联和aVL导联J点明显抬高，以心电监测结合结扎部位以下心肌变苍白、出现搏动减弱，判断大鼠AMI造模成功。

1.2.3 MSCs移植和AMI动物分组干预 将成功造模的AMI大鼠随机分为以下4组，各16只，在结扎30 min后均予干预措施，然后常规关闭胸腔，予青霉素腹腔注射预防感染，单笼饲养。实验观察组：于梗死区边缘心肌组织的3个位点直接注入100 μL生理盐水稀释，含生药20 μg的apr-YTF注射液和100 μL的MSCs细胞悬液。阳性对照组：注入100 μL生理盐水稀释，含药2 μg的rhG-CSF注射液和100 μL的MSCs细胞悬液；空白对照组：注入100 μL生理盐水和100 μL的MSCs细胞悬液；模型对照组：注入100 μL生理盐水和100 μL的PBS缓冲液。

1.2.4 检测指标与方法 MSCs移植和分组干预后4周，每组随机取8只大鼠，应用PcLab生物医学信号采集处理系统测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升及下降最大速率(±dp/dtmax)等心功能参数。测定后分组处死大鼠，取出心脏标本，于细胞注射点获取心肌组织。按免疫组织化学试剂盒说明书进行Cx43的相关抗原抗体免疫组织化学染色，选取心肌梗死边缘区6个高倍(×400)视野，用数字彩色显微图像系统在相同条件下随机拍摄，IOD值表示的指标阳性染色反应强度以Image-Pro Plus图像分析系统测定。IOD值=阳性反应面积/平均光密度(光密度与阳性强度呈反比)，各指标蛋白表达的相对含量取其均值表示。剩余动物进行心脏早期发育基因NKx2.5的检测。Trizol裂解细胞后提取细胞总RNA，经电泳鉴定其完整性后，利用紫外分光光度计测定A260与A280的比值，并计算其浓度，设β-actin为内参照。RT-PCR采用二步法按操作说明进行，逆转录先65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min合成cDNA，再70 ℃变性5 min，接着PCR进行35个循环扩增(94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，最后72 ℃延伸10 min。PCR结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增。利用凝胶成像系统扫描分析NKx2.5与内参β-actin基因的光吸收比值。

2 结 果

2.1 各组患者心功能的比较 实验观察组相较模型对照组，心功能4个指标均有显著改善(P<0.01)，相较阳性对照组，LVSP、 LVEDP、+dp/dtmax的差异有统计学意义(P<0.05)，LVSP显著升高(P<0.01)；阳性对照组相较模型对照组，心功能4个指标均有显著改善(P<0.05)；空白对照组相较模型对照组，+dp/dtmax显著上升(P<0.01)，见表2。

表2 各组患者心功能的比较

2.2 心肌梗死边缘区Cx43表达的比较 心肌细胞Cx43阳性着色颗粒呈分散分布，闰盘区域及侧侧连接的胞膜上均可见，甚至有淡棕黄色的细颗粒存在于心肌细胞内。实验观察组相较空白对照组、模型对照组，IOD值的差异有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组相较空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，相较模型对照组差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组相较模型对照组差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 心肌梗死边缘区Cx43表达(IOD值)的比较

2.3 心肌NKx2.5表达水平的比较 实验观察组和阳性对照组NKx2.5有一定水平的表达，单纯MSCs移植者次之，而模型对照组则只有极弱的表达。半定量分析，实验观察组相较空白对照组和模型对照组，相对光密度值的差异有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组相较空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，相较模型对照组差异有统计学意义(P<0.01)；空白对照组相较模型对照组差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 心肌NKx2.5的RT-PCR产物半定量相对光密度比值

3 讨 论

养心通脉方，由一定比例的人参、丹参、桂枝、枳实、泽泻等药物组成，方中人参大补元气，丹参活血化瘀，桂枝温经通脉而助气化，枳实理气而消痰，泽泻利水而泄浊。该处方主次分明的配伍恰切中AMI本虚标实(气虚血瘀)的病机[7]。从养心通脉方中提取到人参皂苷、人参多糖、丹参酮ⅡA、复方多糖、总生物碱、总挥发油等有效物质部位，经过各有效成分部位的有效剂量配伍实验研究，按照一定的固定比例而研制成为apr-YTF，已被证明具有良好的改善血液循环及抗心肌缺血作用[8-9]。MSCs移植能改善急性缺血心肌功能，然而加入益气活血的apr-YTF，心功能改善更为明显，甚至还优于加之动员MSCs归巢和促进血管、心肌细胞再生的rhG-CSF。

Cx43是构成相邻细胞间隙连接的连接蛋白家族中的一员，心肌组织Cx43的表达甚多，被认为是心脏间隙连接的特有组成成分。正常心肌Cx43经免疫组织化学法检测显示，阳性颗粒分布较为密集而规律。缺血心肌，形态即便尚属正常，却已可见到严重分布紊乱的Cx43阳性颗粒，其端-端相接处颗粒分散于侧-侧相接处，甚至部分分散于细胞质中[10]，本研究的结果与此相符。3组使用了MSCs移植者，相较于模型对照组，心肌Cx43的阳性表达均有所增加，说明MSCs移植能上调Cx43表达，与文献报道一致[11]，显示出较好的恢复梗死心肌心功能作用。实验观察组和阳性对照组表达最多，组间差别不明显。

NKx2.5基因具有心脏显著特异性表达的特点，开始表达于心肌细胞分化之前，是所有脊椎动物心脏发生中最早表达的转录因子，即心脏前体细胞最早的标志物。AMI后NKx2.5表达下降，7 d后有所恢复[12]，移植NKx2.5基因修饰后的MSCs能够改善AMI大鼠心功能[13]。MSCs是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，植入梗死的心肌组织后，现已从形态学、心肌特异性蛋白的表达方面证实，MSCs能分化为心肌细胞，并与AMI微环境的诱导关系密切。本研究表明，急性梗死心肌在apr-YTF、rhG-CSF和MSCs联合移植28 d后，相较于单纯MSCs移植者，NKx2.5的表达较多，说明促进NKx2.5的表达与apr-YTF和rhG-CSF相关。rhG-CSF是公认的促进MSCs分化的诱导剂，本研究观察到，实验观察组和阳性对照组的NKx2.5均高于模型对照组(P<0.01)，前者修复心功能还更佳，说明apr-YTF的效应并不亚于rhG-CSF。

本实验造模的大鼠具有AMI心血瘀阻证的中医证候特点[14]。apr-YTF可有效地改善心肌微循环，促进血管新生[15]，结合本研究，可认为该方促进梗死心肌心功能恢复，是因为切中了AMI心血瘀阻病机，从而改善心血瘀阻证微环境。相较rhG-CSF对MSCs的诱导，apr-YTF对MSCs的作用主要在于改善存活的微环境，促进梗死心肌修复效应略强而毒副作用甚微。在造模过程中，大鼠AMI心脏变苍白，搏动无力，这是微观辨证“气虚血瘀”的证候特点，据研究推测，Cx43和NKx2.5的表达不足可能是AMI气虚血瘀证候的本质之一，apr-YTF恰能提升二者的表达，从而改善AMI气虚血瘀证候。

[1]袁肇凯，陈清华，黄献平，等．养心通脉方有效成分部位的最佳剂量配伍抗急性心肌缺血的研究[J]．湖南中医药大学学报，2008，28(6)：21-25．

[2]刘敬霞，李建生，刘轲，等．脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠神经营养因子表达的影响[J]．时珍国医国药，2013，24(8)：1986-1989．

[3]易为丹，李勇华．急性心肌梗塞心血淤阻证骨髓间充质干细胞动员的临床研究[J]．时珍国医国药，2011，22(9)：2273-2275．

[4]袁肇凯，黄献平，李勇华，等．养心通脉有效部位方动员骨髓间充质干细胞归巢大鼠梗死心肌的实验研究[J]．中华中医药杂志，2012，27(9)：2321-2325．

[5]李勇华，郑景辉，王丽萍，等．养心通脉有效部位方动员心肌梗塞大鼠MSCs归巢及对心功能和病理的影响[J]．时珍国医国药，2010，21(9)：2167-2170．

[6]黄献平，郑景辉，袁肇凯，等．骨髓间充质干细胞移植大鼠缺血心肌后GATA-4mRNA的表达[J]．湖南中医药大学学报，2011，31(9)：12-15．

[7]胡道堂．急性心肌梗死心血瘀阻的病因病机探析[J]．中国中医急症，2010，19(7)：1144-1145,1186．

[8]郑景辉，袁肇凯，黄龙坚，等．养心通脉有效部位方对大鼠骨髓间充质干细胞作用蛋白组学的生物信息学分析[J]．世界科学技术-中医药现代化，2014，16(11)：2460-2469．

[9]陈夏，郑景辉，李勇华，等．养心通脉有效部位方对BMSCs移植心血瘀阻证心肌的实验研究[J]．世界中医药，2015，10(1)：75-79．

[10]徐振平，王华，郭志坤，等．大鼠心脏缺血对间隙连接蛋白Cx43分布的影响[J]．解剖学杂志，2005，28(6)：641-643．

[11]李金轶，钟国强，柯红红，等．同种异体骨髓间充质干细胞移植上调急性心肌梗死大鼠Cx43的表达[J]．基础医学与临床，2010，30(4)：337-342．

[12]姜涛，王春梅，来仪，等．大鼠心肌发育相关基因在心肌梗死后的表达变化[J]．中国生物化学与分子生物学报，2004，20(6)：833-837．

[13]赵东海，张磊，李大鹏．NKX2.5基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响[J]．中国医药导报，2011，8(32)：18-20,封3．

[14]简维雄，陈清华，黄献平，等．影响大鼠心梗模型存活率因素的实验研究[J]．中华中医药学刊，2012，30(7)：1500-1502,1697．

[15]袁肇凯，莫莉，黄献平，等．养心通脉有效部位方对心肌缺血大鼠心血管内皮细胞血管生成的影响[J]．心血管康复医学杂志，2009，18(2)：180-184．

Study of active principle region of YangxinTongmai Formula effects on the acute myocardial infarction in rats with MSCs transplantation*

LiYonghua1,ZhengJinghui2,YuanZhaokai3

(1.ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Chongqing404120,China;2.DepartmentofScientificResearch,AffiliatedRuikangHospitalofGuangxiTraditionalChineseMedicineUniversity,Nanning，Guangxi530011,China;3.InstituteofTraditionalChineseMedicineDiagnostic,HunanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changsha，Hunan410007,China)

Objective To investigate the effect of active principle region of YangxinTongmai Formula(apr-YTF) on the recovery of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) transplantation in acute myocardial infarction (AMI).MethodsAMI rats were divided into model control group,blank control group,positive control group [recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF)] and experimental observation group(apr-YTF).MSCs and the corresponding drugs were administered respectively.PcLab biomedical signal acquisition and processing system was used to measure the cardiac function,and the detection of the gap junction protein 43 (Cx43),and RT-PCR was used to detect the early development of NKx2.5 gene.ResultsThe heart function recovery in the experimental observation group was best.Myocardial cell Cx43 positive staining particles were dispersed,positive staining particles were mainly distributed in the end connected to the intercalated disc area and lateral side was connected with the cell membrane,the IOD value of Cx43 was the highest in the experimental observation group.There was a certain level of expression in each group of NKx2.5,and the expression of the observation group was the strongest,while the model group had only a very weak expression.ConclusionApr-YTF can promote MSCs transplantation to repair acute myocardial infarction and improve heart function.

stem cells;myocardial infarction;YangxinTongmai;early cardiac development gene

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.34.004

国家自然科学基金资助项目(81102595，30772696)。

:李勇华(1976-)，副教授，博士，主要从事中西医结合内科学教学和临床工作。

R543

A

1671-8348(2015)34-4762-03

2015-05-18

2015-07-09)