氨氯地平抑制小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16体内转移的作用及相关机制研究

张 旭 ，艾志国，扶 玲(惠州市中心人民医院药剂科，广东 惠州 516000)

恶性肿瘤最显著的生物学标志就是肿瘤的侵袭和转移，肿瘤一旦发生侵袭和转移，则病死率极高。影响肿瘤侵袭、转移的因素有很多，其中最让人关注的就是白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)。IL-8 为肿瘤治疗的新靶点。IL-8 最初定义为中性粒细胞趋化因子，是一种多功能趋化因子，在炎症中有重要作用，后来还发现其可促进细胞有丝分裂与血管生成［1-2］。目前，很多肿瘤细胞均可高表达IL-8，且肿瘤细胞株转移和浸润能力与IL-8 表达程度称负相关。研究结果显示，IL-8 与肿瘤的生长、浸润、转移成一定的相关性，乳腺癌、结肠癌、肺癌等肿瘤均呈IL-8 高表达［3］。近几年来的研究结果显示，IL-8 的表达与细胞内Ca2+离子水平相关;其中，某些诱导型的IL-8 有钙离子浓度依赖性，如氧化型胆固醇诱导的IL-8分泌，给予钙通道阻滞剂可以显著抑制IL-8 的分泌和其信使核糖核酸(mRNA)水平的表达［4］。由此可推测，细胞内钙离子水平对恶性肿瘤侵袭、转移有极其重要的意义。氨氯地平为二氢嘧啶类钙通道阻滞剂，研究结果表明，氨氯地平可抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231 的侵袭，但具体机制尚不明确［5］。本实验采用黑色素瘤高转移细胞株B16 为侵袭株，研究不同剂量氨氯地平抑制肿瘤转移的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与肿瘤细胞株

C57 BL/6J 小鼠，7 周龄，体质量18 ～20 g，来源于重庆医科大学动物中心;细胞株:黑色素瘤高转移细胞株B16，由重庆医科大学超声研究所提供。

1.2 药品与试剂

苯磺酸氨氯地平片(浙江新赛科药业有限公司，批号:H20010699);兔抗鼠IL-8 抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司);DAB 显色试剂盒和SP-9000 通用型检测试剂盒(均购自北京中杉金桥生物技术有限公司);BCA 蛋白定量检测试剂盒(购自美国Hyclone 公司);IL-8 的上下游引物(由上海生物工程有限公司合成);mRNA 抽提TRIzol 试剂盒，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测试剂盒(Toyobo 公司);其他试剂均为分析纯，符合实验要求。

1.3 方法

1.3.1 制作模型:将肿瘤细胞(1 ×106/L)接种在小鼠腋下，待肿瘤长至1 cm3时在无菌环境中取出肿瘤。制成单细胞悬液，浓度约为2 ×107/L。取出该悬液0.20 ～0.25 ml，分别接种于小鼠右腹股沟。对照组小鼠给予0.9%氯化钠注射液;治疗组小鼠给予不同剂量的氨氯地平(1、3、10 mg/kg)，统计小鼠肿瘤生长情况及身体情况。

1.3.2 抑瘤作用:统计药物对肿瘤的抑制作用。各组小鼠接种后22 d，取出肿瘤称其质量并计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1 -实验组瘤质量/对照组瘤质量)×100%。

1.3.3 IL-8 蛋白表达:用免疫组织化学法，将肿瘤组织包埋于石蜡中，常规脱蜡，给予枸橼酸抗原修复;然后滴加30 ml/L H2O2去离子水于室温下孵育15 min;山羊血清封闭;倾去血清，滴加兔抗鼠IL-8 抗体(1 ∶100 稀释)放入冰箱过夜;加入山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG，含辣根过氧酶标记);二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木精复染，脱水，透明封固;其中阳性标准为胞膜和胞浆有棕黄色颗粒沉着。用Imagepro Plus 5.0 图像分析软件，测量其累积光密度值，光密度值越大，反映细胞内蛋白免疫活性(表达)越高。

1.3.4 IL-8 的mRNA 表达:取各组肿瘤组织匀浆，TRIzol 剂一步法提取组织中总RNA，紫外分光光度法测定总RNA 的含量和纯度。内参照为β 肌动蛋白(β-actin)，半定量RT-PCR 法检测IL-8 的mRNA 表达。IL-8 引物序列:上游引物5'-TACTCCAAACCTTT CCACCC-3'，下游引物3'-AACTTCTCCACA ACCCTCTG-5，扩增片断长度为155 bp;β-action 引物:上游引物 5' GAGCTATGAG CTGCCTGACG' 3，下 游 引 物 3'-GTAGCACCTGGCGTTCACGA-5'，产物长度为517 bp;25 μl 体系，互补脱氧核糖核酸(cDNA)为2.5 μl，上、下游引物各0.5 μl，其余试剂按检测试剂盒定量加入。预变性5 min，进入PCR 循环，循环参数:变性94 ℃、30 s，退火52 ℃，72 ℃延伸30 s，30 个循环，72 ℃延伸5 min。2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察，半定量法分析DNA 灰度值，目的条带与内参β-action灰度值之比，即为目的基因的相对mRNA 含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.0 统计软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差(¯x±s)表示，数据处理采用单因素方差分析，各组均数间的比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义;采用IPP 软件分析免疫组织化学结果。

2 结果

2.1 各组小鼠的抑瘤情况比较

各个剂量的氨氯地平均对肿瘤有抑制作用，且呈现出一定的剂量依赖性。与对照组比较，氨氯地平各剂量组小鼠的抑瘤情况与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 各组小鼠的抑瘤情况比较(¯x±s)Tab 1 Tumor inhibition rate in each group(¯x±s)

2.2 氨氯地平对IL-8 蛋白表达的影响

与对照组比较，治疗组小鼠IL-8 蛋白表达阳性数较少;随着氨氯地平给药剂量的加大，小鼠IL-8 蛋白表达阳性数减少呈现一定的剂量依赖性，各组差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

2.3 氨氯地平对IL-8 的mRNA 表达的影响

通过RT-PCR 电泳条带的灰度值来判断IL-8m 的RNA 表达，采用凝胶成像系统系统分析软件计算。结果显示，与对照组比较，治疗组小鼠IL-8 的mRNA 表达降低，且随着剂量的增加，IL-8 的mRNA 表达逐渐降低，见图2。

3 讨论

图1 不同剂量氨氯地平对小鼠肿瘤组织中IL-8 蛋白表达的影响(1 ×200)Fig 1 Effects of different dose of amlodipine on the expression level of IL-8 protein in each group(1 ×200)

图2 不同剂量氨氯地平对小鼠肿瘤组织中IL-8 的mRNA 表达的影响Fig 2 Effects of different dose of amlodipine on the mRNA expression of IL-8

恶性肿瘤具有的侵袭和转移的特点，是其病死率极高、预后差的重要原因。肿瘤的侵袭、转移最关键的步骤是肿瘤血管的生成，该过程包括微血管基底膜蛋白水解、内皮细胞增生、迁移管状结构形成和成熟，这一过程是由很多血管生成因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或血管生成抑制因子如INF-Y、ERL-CXC 的释放引起的。IL-8 是一种趋化因子，对炎症反应和免疫过程的调节起重要作用［6］。IL-8的表达强度与肿瘤组织(细胞)生长、侵袭和转移成正相关，IL-8 在肿瘤过程中参与很多环节，它被发现可以促进肿瘤生长，相关的作用机制可能与其自分泌作用或促进血管生长有关［7］。趋化因子通过两个方面对肿瘤产生影响，一是使免疫细胞活化，抑制血管的增生，从而产生抗肿瘤作用;二是促进肿瘤生长，增加肿瘤活性，使细胞外基质消化功能增加，从而进一步促进肿瘤的生长、侵袭、转移［8］。有研究认为，IL-8 在多种肿瘤的生长、转移过程中发挥了重要作用［9-11］。研究结果显示，IL-8 可以促进肿瘤血管的形成:转染IL-8 后的细胞培养液可以刺激人脐静脉内皮细胞增殖，同时该细胞可以促使裸鼠体内形成的肿瘤生长速度快，且血管丰富［12］。Heidmenan等［13］的研究结果表明，IL-8 可使血管的通透性增加，可促进肿瘤的浸润与转移。另外，IL-8 也可促进乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等细胞的增生、迁移。一系列的研究结果显示，IL-8 以某种分泌形式作用于肿瘤细胞，从而产生促进肿瘤的生长、浸润与转移的作用。因此近几年来，将IL-8 作为肿瘤治疗的新靶点的研究备受关注。

本研究结果显示，氨氯地平对肿瘤的体内生长有一定的抑制作用，与前期的体外研究结果一致［14］。抑制肿瘤生长是抑制肿瘤转移的基础。在氨氯地平给药期间，小鼠整体生存状态良好，明显优于对照组，并且氨氯地平并未显示出明显的毒副作用。氨氯地平对肿瘤的抑制作用机制很可能与其通过阻断钙离子通道，下调IL-8 的转录有关，使其所介导的一系列肿瘤的转移和侵袭均受到一定程度的影响。但具体机制尚不明确，有研究分析IL-8 与肿瘤的抑制和抗转移作用，可能与抑制细胞凋亡、调节细胞外基质及其自分泌作用有关。

一方面，IL-8 可在白血病患者的B 细胞呈高表达，使白血病细胞的生存延长，可能是通过上调B 淋巴细胞瘤-2 基因的表达，抑制细胞凋亡，从而发挥效应。另一方面，研究结果表明，IL-8 可通过上调细胞及其相关基质黏附蛋白的表达，从而参加恶性肿瘤细胞的侵袭和转移过程。研究发现，IL-8 通过与肿瘤细胞膜上受体结合而促进肿瘤生长，并可提高肿瘤组织生长速度，促进肿瘤转移的发生，IL-8 若在肝癌患者中呈高表达，则其恶性程度高，预后极差，但具体机制尚需进行进一步的实验证明［15］。

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