贵州地区丙型肝炎患者病毒基因型与外周血辅助性T细胞因子表达相关性研究

2015-01-07 07:24梁跃东杨兴林洪章萍熊金凤黄海
贵州医药 2015年4期
关键词:丙型肝炎基因型细胞因子

梁跃东 杨兴林 洪章萍 熊金凤 黄海

(1.贵阳市第五人民医院,贵州 贵阳550004;2.贵阳医学院检验系,贵州 贵阳550004)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染后约80%发展为慢性肝炎,约25%发展为肝硬化、肝癌[1]。引起丙肝慢性化的重要原因之一是宿主免疫功能的变化,其中T淋巴细胞及其所分泌的细胞因子的变化显著影响了感染的进程。因此了解近年来贵州地区 HCV流行株的基因型,了解HCV感染过程中T淋巴细胞及其细胞因子的变化,对临床治疗具有指导意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择贵阳市第五人民医院2011年10月至2013年7月传染科门诊和住院患者中HCV RNA为阳性的慢性丙肝患者198例,其中男109例,女89例,年龄20~74岁;诊断均符合2004年中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会《丙型肝炎防治方案》,所有患者的抗-HCV检测为阳性,且排除其他类型肝炎病毒感染,均未使用过干扰素和其他免疫调节剂。45例健康对照标本来自本院健康体检人群。

1.2 HCV-RNA定量检测 采用实时荧光定量(RQ-PCR)法,采用上海科华股份有限公司生产的HCV荧光定量PCR试剂盒检测,灵敏度为5×102IU/mL。

1.3 HCV基因分型 用异硫氰酸胍(Trizol)-氯仿-异丙醇抽提血清中的HCV RNA,用75%的乙醇洗涤RNA沉淀,15μL DEPC水溶解核酸-70℃保存或立即冰浴备用。依据HCV Core-E1区核苷酸序列合成4条引物,引物由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列为:CEI-ESP 5’-GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC-3’,CEI-EAP 5’-CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT-3’,CEI-ISP 5’-AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT-3’,CEI-IAP 5’-GT-TCATCATCATATCCCATGCCAT-3’。逆转录及首轮PCR同时进行,逆转录反应条件为:42℃40min;94℃15s,60℃15s,72℃30s,共扩增30个循环;72℃延伸5min,得到外扩增PCR产物。取2μL为模板,进行第2轮PCR反应,PCR循环参数与首轮相同,得到内扩增PCR产物,扩增片段为474bp。PCR产物置1.5%的琼脂糖电泳20min,凝胶成像分析仪观察结果。取阳性PCR产物,用Promega的PCR DNA纯化体系进行纯化,送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序,CEl-ISP作为测序引物。

1.4 细 胞 因 子 检 测 血 清IL-2、IL-8、IL-10 和TFN-α检测采用ELISA法,试剂盒购自生物晶美工程有限公司,按试剂盒说明方法进行检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,年龄、血清细胞因子水平数据用t检验,以(¯x±s)表示,性别资料用χ2检验,不同基因型细胞因子水平比较用F检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 198份丙型肝炎患者HCV基因分型 结果显示,1a型4例(2.02%),1b 型71例(35.86%),2a型9例(4.55%),3a型29例(14.65%),3b型47例(23.74%),6a 型 37 例 (18.69%),6d 型 1 例(0.50%)。

2.2 慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平与正常对照组的比较 198例慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平与正常对照组比较结果见表1,血清IL-8与正常对照组比较差异无统计学意义,而慢性丙型肝炎患者血清IL-2、IL-10、TNF-α与正常对照组比较差异均有统计学意义。

表1 慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平与正常对照组比较 (pg/mL)

2.3 慢性丙型肝炎患者不同基因型细胞因子水平比较 184例不同基因型之间细胞因子水平的结果比较,发现IL-2与TNF-α在各基因型间比较差异无统计学意义。IL-8在lb型患者血清中含量与3a、3b、6a型患者比较差异有统计学意义(P<0.05),3a、3b、6a型患者血清中IL-8含量两两比较差异无统计学意义(P>0.05);IL-10在lb型患者血清中含量与3a、3b、6a型患者比较差异有统计学意义(P<0.05),3a、3b、6a型患者血清中IL-10含量两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。1a、2a、6a检测例数较少未进行统计比较。见表2。

表2 丙型肝炎患者不同基因型细胞因子水平比较

3 讨 论

慢性丙肝感染可导致肝硬化、原发性肝癌,但发病机制尚不明确。近来发现,宿主免疫应答在HCV感染的慢性化中,尤其是Th1/Th2相关因子表达失衡在丙型肝炎发病机制中可能起重要作用[2-3]。细胞毒T淋巴细胞(CTL)是主要的效应细胞,激活的CTL细胞通过释放穿孔素和Fas介导的细胞凋亡途径清除病毒,同时导致肝细胞炎症坏死。CTL细胞需在Th细胞辅佐下才能充分发挥作用。Th细胞即辅助性T淋巴细胞,前体Th0细胞可分化为Th1/Th2两个优势亚型,Thl细胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN 、TNF等,能促进细胞免疫,对 CTL的功能有辅佐作用;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等,对 Th1细胞有抑制作用,它抑制细胞免疫,增强体液免疫,细胞因子水平和Thl/Th2优势亚群两者互相影响,互为因果。Thl细胞有利于病毒的清除而Th2细胞主要与组织损伤及慢性化有关。Thl细胞与Th2细胞之间的活性的平衡决定了感染的结局及临床表现,进而影响HCV感染者的慢性化和临床转归。

本文结果显示,慢性丙型肝炎与正常对照组比较,丙型肝炎患者体内存在Th1型细胞因子分泌IL-2、TNF-α明显降低,Th2型细胞因子分泌IL-10增高,可抑制宿主的细胞免疫功能,使机体不能清除病毒,可能是HCV感染慢性化的重要机制,与相关报道[4-5]相符。分析以上研究结果可知,CHC患者体内Th2类细胞因子均呈高表达状态,Th1类细胞因子表达情况的报道尚不完全一致,可能与收集病例样本有关。本研究也发现IL-2、TNF-α表达较低的现象,CHC患者Th1类细胞因子表达受到抑制,而Th2类细胞因子高表达,可能Th1类细胞因子水平低下是导致机体细胞免疫功能缺陷、使病毒清除障碍及感染慢性化的原因之一。

目前干扰素-a联合利巴韦林(RBV)是公认治疗慢性丙型肝炎有效的药物,能有效抑制患者HCV复制,减轻肝脏炎症坏死和肝纤维化。在治疗前评估、疗效预测及个体化疗程,其中基因型最为重要,目前多数指南推荐基本疗程为:基因1型48周,基因2/3型24周[6]。近年来,相关的研究结果显示,在治疗过程中Thl/Th2类相关因子均有不同的变化,贾红宇等[7]对24例HCV携带者和27例CHC患者血清IL-18和IL-10水平的研究发现,CHC患者该两种细胞因子水平明显高于正常对照组和HCV携带组,27例CHC患者经干扰素-a治疗6个月后IL-18和IL-10水平较治疗前明显降低。血清中IL-10水平由高到低依次为:治疗无应答组>部分应答组>完全应答组。胡敏涛等[8]报道用聚乙二醇干扰素a-2b治疗的慢性丙型肝炎患者58例,用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测治疗前后患者血清INF-r、IL-2、IL-6、IL-10的变化,治疗48周后应答组与无应答组比较,INF-r、IL-2水平均显著升高,IL-6、IL-10水平则显著降低,差异均有统计学意义。慢性丙型肝炎患者血清IL-8含量明显增高,IL-8能降低2’-5寡腺苷合成酶活性,抑制内源性IFN-a的合成,有研究证明,NS5A基因的刺激可使IL-8的合成增加8~12倍,发现非结构蛋白NS3和NS4抗体水平与病毒血症程度无相关性,高水平病毒血症患者的抗-NS5抗体显著增高,说明NS5蛋白是激活HCV复制的重要因子。以上研究结果表明,某些细胞因子,特别是IL-2、IL-10、IL-8、TNF等的水平,可做为CHC预后和预测IFN治疗效果的指标。本实验通过对CHC患者血清IL-2、IL-10、IL-8、TNF-a及基因型检测,结果显示在治疗前CHC患者1b型中外周血IL-8、IL-10明显高于3a、3b、6a型,提示1b型患者抗病毒治疗效果不佳的因素之一。在基因型与细胞因子的关系报道较少,在不同基因型CHC患者抗病毒治疗过程中细胞因子的动态变化正做进一步研究。

总之,丙型肝炎的显著临床特点就是极易慢性化,而T淋巴细胞以及细胞因子在HCV感染慢性化中起着重要作用,Thl/Th2相关细胞因子水平不但与丙型肝炎的慢性化和疾病进程有关,而且与IFN疗效关系密切。HCV基因型对于肝损伤、疾病进展和转归的影响尚有不同观点,不同基因型与HCV感染后的病情变化以及干扰素的疗效有一定相关性。如何能把基因型与相关细胞因子水平的变化在预测丙型肝炎的诊断、治疗和预防,规范检测方法,仍需进一步深入研究。

[1] Hezode C,Forestier N,Dusheiko G,et al.Telaprevir and peginterferon with or with out ribavirin for chronic HCV infection[J].N Engl J Med,2009,360(18):1839-1850.

[2] 董漪,张鸿飞,陈昊,等.小儿慢性丙型肝炎外周血T细胞亚群和TH1/TH2型细胞因子的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志,2007,21(1):26-28.

[3] Par G,Berki T,Palinkas L,et al.Immunology of HCV infection:the causes of impaired Cellular immune response and the effect of antiviral treatment[J].Orv Hetil,2006,147(13):591-600.

[4] 牛文强.慢性丙型病毒性肝炎患者血清细胞因子水平检测及临床意义[J].国际检验医学杂志,2012,33(8):983-984.

[5] 张颖,谢志宏.慢性丙型肝炎患者外周血Thl/Th2表达失衡的研究[J].现代实用医学,2012,24(11):1274-1276.

[6] 吴晓宁,彭真,贾继东.丙型肝炎治疗及疗效判断指标进展 [J].中 华 检 验 医 学 杂 志,2010,33(11):1100-1102.

[7] 贾红宇,盛吉芳,周林福,等.血清IL-18和IL-10在慢性丙型肝炎发病中作用的临床研究[J].中国感染控制杂志,2006,5(4):303-305.

[8] 胡敏涛,毛燕群,裴豪,等.聚乙二醇干扰素治疗丙型肝炎前后淋巴细胞亚群及辅助性T淋巴细胞因子的变化[J].中国全科医学杂志,2011,14(11):3829-3832.

猜你喜欢
丙型肝炎基因型细胞因子
围剿暗行者——丙型肝炎
抗GD2抗体联合细胞因子在高危NB治疗中的研究进展
急性心肌梗死病人细胞因子表达及临床意义
α-干扰素联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎
丙型肝炎治疗新药 Simeprevir
细胞因子在慢性肾缺血与肾小管-间质纤维化过程中的作用
慢性丙型肝炎中医治疗进展
西安地区育龄妇女MTHFRC677T基因型分布研究
作物遗传育种研究进展Ⅴ.表型选择与基因型选择
细胞因子在抗病毒免疫中作用的研究进展