一株凝结芽孢杆菌的筛选及鉴定

傅 奇 肖玉娟

一株凝结芽孢杆菌的筛选及鉴定

傅 奇 肖玉娟

凝结芽孢杆菌是一种美国FDA批准用于食品的益生菌，可定殖于肠道中并产生乳酸，同时由于其可产生芽孢，不良环境耐受性好，菌体在通过肠前消化道时可保持较高的存活率，是一种有重要价值的益生菌。但目前我国尚未批准用于食品中，相关研究较少。本文从土壤中筛选得到一株芽孢杆菌，经16s rDNA和生理生化鉴定，确定其为凝结芽孢杆菌，命名为Bacillus coagulans HXP-1。

材料与方法

1．样品来源

厦门市菜地土壤。

2．培养基

筛选培养基(营养琼脂，/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g；pH 7.0-7.2。

富集培养基（kitahara&suzuki培养基,/L）[1]：葡萄糖20g，酵母提取物5g，蛋白胨5g，琼脂15g。

发酵培养基（/L）：葡萄糖 120g，蛋白胨19g，NH4Cl 4g，（NH4）2HPO42g。

产芽孢培养基（TM培养基，/L）：酵母提取物1g，硫酸铵10g，肉浸膏5g，番茄汁200mL，α-甲基葡糖苷5g，CaCO320g；pH 5.5。

碳水化合物产酸培养基 （/L）：（NH4）2HPO41g，KCl 0.2g，MgSO40.2g，酵母提取物0.2g，琼脂5g，溴百里酚蓝（0.04g/100mL）20mL；碳水化合物1g。

V-P试验培养基（/L）：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，K2HPO45g；pH 7.0-7.2。

CASO肉汤（/L）：胰蛋白胨 17g，大豆木瓜蛋白酶消化物 3g，氯化钠 5g，磷酸二氢钾 2.5g，葡萄糖2.5g，pH 7.3。

蛋白胨水培养基（/L）：蛋白胨 1g，NaCl 0.5g；pH 7.8。

DNA酶试验培养基(/L)：酪朊水解物 15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 5g，DNA 2g，甲苯胺蓝0.1g，琼脂15g。

3．菌种筛选

取1g土样，加入10mL无菌富集培养基中，80℃处理30min后，于30℃厌氧培养，当培养液pH下降至4.0后，以生理盐水稀释至10-8，各稀释度涂布筛选平板，平板密封后37℃培养，生成菌落后挑取菌落测定接触酶和观察生孢情况，取接触酶阳性并产芽孢的菌落继续纯化。

4．菌种鉴定

由国家海洋局第三海洋研究所进行16s rDNA鉴定，生理生化鉴定依据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[2]《伯杰细菌鉴定手册》[3]与《常见细菌系统鉴定手册》[4]进行，乳酸检测按照《食品添加剂乳酸（GB 2023-2003）》[5]进行。

结果与讨论

从厦门市菜地土壤中筛选得到一株产乳酸的、产芽孢的菌株，编号HXP-1，经纯化保藏后，送至国家海洋局第三海洋研究所——中国海洋微生物菌种保藏管理中心，进行16s rDNA鉴定。

1．16s rDNA鉴定结果

测序结果显示HXP-1 16S rDNA序列长度为1514 bp，碱基序列如下：

16s rDNA序列通过细菌模式种网站对比，结果显示菌株HXP-1与8株模式种的16s序列相似度高于99.5%。

表1 HXP-1菌株16s序列EZTaxon网站对比结果

16s rDNA序列通过NCBI比对，结果显示菌株HXP-1与100余株菌株的16s序列相似度高于99%，相似菌株包括Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）、Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）、Bacillus methylotrophicus（甲基营养型芽孢杆菌）、Bacillus polyfermenticus（多酵解芽孢杆菌）、Bacillus velezensis（贝莱斯芽孢杆菌）等。

表2 HXP-1菌株16s序列NCBI网站对比结果

经中国海洋微生物菌种保藏管理中心16s rDNA测序，该菌株初步判断为芽孢杆菌群的一个种。

2．生理生化鉴定结果

生理生化试验结果如表3所示，参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[2]《伯杰细菌鉴定手册》[3]与《常见细菌系统鉴定手册》[4]可知，菌株HXP-1属于凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），命名为Bacillus coagulans HXP-1。

表3 HXP-1菌株生理生化试验结果

讨论与分析

芽孢杆菌由于菌种间亲缘关系较近，常用的16s rDNA难以鉴定到种，因此鉴定时通常需进行生理生化鉴定或看家基因测序，本文中筛选到的菌株Bacillus coagulans HXP-1，其16s rDNA序列与多种芽孢杆菌具有极高的相似度，生理生化结果与凝结芽孢杆菌完全吻合，但与此同时，与NCBI基因库比对时发现该菌株与已登记在库的凝结芽孢杆菌16s序列差异较大，相似度最高仅为93%，表明该菌株在部分生理和代谢特性方面可能与多数凝结芽孢杆菌存在差异，具有重要研究价值。

（作者单位：厦门华厦学院）

[1]Stephanie Doores,Dennis Westhoff.Journal of Food Science[J].1981,46∶810-812.

[2]凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京∶中国轻工业出版社,1999∶29-31.

[3]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册 [M].第8版.北京∶科学出版社,1984∶170-178.

[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册 [M].北京∶北京科学出版社,2001∶43-65.

[5]GB 2023-2003，食品添加剂乳酸[S].

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