老年COPD患者Treg与TGF-β1的变化及其意义

黄 芪，刘先玲，徐 海，付东伟

(重庆三峡中心医院老年科，重庆万州 404000)

论著·临床研究

老年COPD患者Treg与TGF-β1的变化及其意义

黄 芪，刘先玲，徐 海，付东伟

(重庆三峡中心医院老年科，重庆万州 404000)

目的通过观察老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性加重期、稳定期患者和健康老年人外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例变化及COPD患者血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)水平的相关性，探讨Treg、TGF-β1在老年COPD发病中的作用。方法选择2012年3月至2014年2月在该院老年科的COPD急性加重期患者26例(急性期组)、稳定期患者23例(稳定期组)，选择同期20例健康体检者为对照组，用流式细胞仪检测外周血中Treg表达比例，用ELISA法检测血清TGF-β1。结果3组受检者外周血Treg比例，各病例组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，急性期组与稳定期组比较差异有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1水平，急性期组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；各组Treg与TGF-β1均无相关性(P>0.05)。结论Treg细胞在老年COPD急性加重过程中有重要作用，但Treg与TGF-β1无明显相关性，老年患者体内存在免疫功能紊乱或异常。

肺疾病，慢性阻塞性；老年人；CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞；转化生长因子-β1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病，COPD患病率占40岁以上人群的8.2%。目前认为COPD的发病机制与遗传易感性、氧化/抗氧化、气道炎症(包括炎性细胞浸润、细胞因子释放及细菌病毒感染)等有关，但尚未完全阐明。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)是T细胞中可以抑制免疫应答的细胞群[1]，主要通过抑制性调节CD4+和CD8+T细胞的活化与增殖，达到免疫的负调节作用。其在维持机体免疫自稳、免疫应答的负调节及自身免疫耐受中发挥重要作用，并且具有抗炎作用。转化生长因子-β(TGF-β)是一种具有调节T细胞生长及发育的多功能细胞因子，TGF-β在维持Treg功能并诱导其生成中发挥重要作用[2]。本文通过检测外周血中Treg、TGF-β1的表达水平，从而初步探讨其在老年COPD发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例组：选择2012年3月至2014年2月在本院老年科收治住院和门诊随访的老年COPD患者共49例，急性期患者26例(急性期组)，其中男16例，女10例，年龄64～88岁，平均(72.7±5.8)岁，稳定期患者23例(稳定期组)，其中男13例，女10例，年龄62～82岁，平均(70.6±6.1)岁。对照组：同期在本院体检中心健康体检者20例，其中男11例，女9例，年龄62～80岁，平均(68.7±4.7)岁。病例组与对照组的年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：参照COPD诊治指南(2007年修订版)中急性加重期和稳定期的诊断标准。急性加重期是指患者出现超越日常状况的持续恶化，并需改变基础COPD的常规用药者，通常在疾病过程中，患者咳嗽、咳痰、气短和(或)喘息加重，痰量增多，呈脓性或黏脓性，可伴发热等炎症明显加重的表现。稳定期则指患者咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或轻微[4]。排除标准：某些肺部疾病如哮喘、间质性肺炎、支扩、肺结核；心脑血管疾病如冠心病、老年痴呆等；内分泌疾病如甲状腺功能亢进、糖尿病等；肿瘤及自身免疫性疾病。对照组近1个月内无呼吸道感染病史。入组患者均通过医院伦理认证及签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 Treg的测定 Foxp3和淋巴细胞亚群测定采用美国BD公司的FACS Calibur流式细胞仪检测。各组受试者均清晨应用抗凝负压真空采血管采集空腹外周静脉血3 mL，将静脉血采用淋巴细胞分离液分离外周单个核细胞(PMBC)，标本在1 h内进行检测。单克隆抗体包括抗CD4-PerCP、CD25-FITC和各阴性对照IgG均为美国BD公司产品，抗Foxp3-PE单抗和染色缓冲液为美国eBioscience公司产品。取两支试管，首先分别加入分离后标本100 μL，将抗人CD4-PerCP/CD25-FITC抗体及其阴性同型对照IgG各10 μL加入后混匀，室温避光放置30 min；加入红细胞裂解液，避光室温孵育，用4 ℃预冷的PBS清洗，离心弃上清液；再加入新鲜配制的固定/破膜应用液1 mL，混匀并避光15 min；然后加入破膜缓冲液1 mL孵育20 min，离心弃上清液；最后，各管中加入5 μL的抗Foxp3-PE单抗及阴性同型对照IgG，混匀后4 ℃避光孵育30 min，用破膜缓冲液2 mL清洗两遍，分别离心弃上清液，加入500 μL PBS后混匀上机，经FAC Sort流式细胞仪分选细胞、在FSC-SSC点图上选定淋巴细胞群，用Cell Quest软件分析数据，以荧光抗体染色阳性细胞的百分数记录结果。

1.2.2 TGF-β1的测定 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TGF-β1水平，试剂盒购于武汉博士德公司，按照试剂盒说明进行检测。

2 结 果

2.1 各组的基线资料 急性期组的淋巴细胞比例与稳定期组、对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 各组间调节性T细胞比例及TGF-β1水平的比较 3组受检者外周血CD4+CD25+细胞比例，急性期组、对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。CD4+CD25+Foxp3+细胞比例，急性期组、稳定期组比较差异有统计学意义(P<0.05)；各病例组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。TGF-β1水平，急性期组为(34.05±6.56)μg/L、稳定期组为(30.61±6.58)μg/L，对照组为(27.22±8.43)μg/L，急性期组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 各组间外周血中调节性T细胞的比例

2.3 相关性分析 COPD急性期、稳定期组及对照组的Treg与TGF-β1均无相关性(r=-0.118、-0.049、-0.021，P>0.05)。

3 讨 论

Treg是一类有负调节作用的T细胞亚群，但目前对其产生、成熟及迁移等机制尚不完全清楚，具有免疫无能和免疫抑制特性，分为CD4+Treg、CD8+Treg、自然杀伤性T细胞(NKT Treg)、双阴性调节性T细胞(DN Treg)。Treg在人和小鼠的外周血及淋巴组织中约占CD4+T细胞5%～10%，包括在胸腺内自然发育的天然Treg(nTreg)和诱导性调节性T细胞(iTreg)。nTreg大部分为CD4+CD25+Treg，在预防病理性自身免疫反应方面起作用；iTreg是外周CD4+Foxp3-T细胞在受到特异性抗原刺激并在IL-2、TGF-β等细胞因子的诱导下分化而来[5]。Sakaguchi等[6]于1995年首次报道在正常人和小鼠的外周血和脾脏组织的CD4+T细胞约有5%～10%持续高表达CD25分子(IL-2受体α链)，去除这群细胞后可引发各种自身免疫性疾病，提示CD4+Treg直接参与了自身免疫反应的抑制过程。除了CD4、CD25，CD4+CD25+Treg表面还表达了叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)、细胞毒T细胞相关抗原4(CTLA4)等。Foxp3持续表达于Treg，低表达于活化的效应T细胞，作为特异性表达的转录因子，是CD4+CD25+Treg发育、活化、发挥功能的关键，常被作为鉴定或筛选标志[7-9]。另外，有研究证实，通过应用CTLA4特异性阻断抗体或CTLA4缺失的Treg都显示功能性CTLA4的缺失，使Treg通过树突状细胞介导的效应T细胞的抑制效应降低[10]。TGF-β抑制大多数T、B细胞系在体外的增殖和分化，抑制中性粒细胞和T细胞黏附于内皮细胞，从而限制了炎症细胞补充到损伤部位，上调抑制性细胞因子。TGF-β在维持Treg功能并诱导其生成中发挥重要作用，它能诱导Foxp3和Treg分化，动物实验表明，敲除TGF-β基因的小鼠Treg数量明显减少，而且TGF-β培养幼稚CD4+Treg可诱导Foxp3的表达[3]。

本研究中老年COPD患者，无论在急性期还是稳定期，外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例均显著高于对照组，且急性期与稳定期组的差异也有统计学意义(P<0.05)，但CD4+CD25+T细胞的比例，仅急性期组与对照组有差异。在Domagala-Kulawik等[11]的研究中，COPD患者CD4+CD25+T细胞比例虽是低于对照组的，但CD4+CD25+CTLA4+T细胞却显著高于对照组，这表明Treg不仅参与老年COPD的发病，而且在急性加重期Treg控制了COPD患者由细胞免疫介导的病理反应，降低了机体病理损害，但同时也会造成病原体在体内的持续存在，这可能是COPD患者急性加重期感染不易控制的原因之一。然而，也有学者认为在吸烟和COPD稳定期患者的支气管肺泡灌洗液中CD4+CD25+T细胞并未发挥免疫调节作用[12]，本文的缺陷在于未能将各组患者吸烟指数是否存在差异进行搜集和分析。尽管在动物实验中TGF-β1在Treg细胞的生成及分化中有重要调节作用[3]，但本研究里TGF-β1水平仅在急性期组与对照组中有显著差异，各病例组与对照组的Treg比例与TGF-β1水平均无相关性，说明在总体环境下，尤其是老年患者体中Treg的诱导及生成不是取决于某一细胞因子的独立作用，而是综合多种细胞因子及信号通路共同作用后的结果[13-14]，新近研究也进一步显示局部微环境中细胞因子的差异可显著影响Treg的分化过程，反映机体免疫应答调节的复杂性[15]。老年人免疫功能紊乱或异常也导致其易患慢性感染性疾病，细胞免疫尤其是调节性T细胞在COPD的发生、发展及预后中发挥着重要作用、联系紧密，说明了COPD极有可能是一种自身免疫性疾病，这也为临床上针对该疾病的免疫治疗及新策略的开发提供了重要理论依据[16-17]。

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The change and clinical significance of T cells and TGF-β1 in the senile COPD patients

HuangQi,LiuXianling,XuHai,FuDongwei

(DepartmentofGeriatric,ChongqingThreeGorgesCentralHospital,Chongqing404000,China)

ObjectiveTo observe the expression level of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in the peripheral blood of acute and stable senile COPD patients,and analyze the correlation between Treg cells and TGF-β1 of senile COPD,then investigate the role of Treg cells and TGF-β1 in the onset of senile COPD.MethodsTotally 26 patients with acute stage and 23 patients with stable stage were investigated as acute group and stable group,they came from the department of geriatric of our hospital form March,2012 to February,2014.Meanwhile,20 healthy people were selected as control group.The proportion of Treg cells in peripheral blood was measured by flow cytometry method and the level of TGF-β1 in serum was measured by ELISA.ResultsThe percentage of Treg on peripheral blood in acute and stable groups were significantly higher than control group(P<0.01),the difference also existed in acute and stable group(P<0.05);the level of TGF-β1 in serum of acute group was higher than control group(P<0.01),there was no correlation between the proportion of Treg and TGF-β1(P>0.05).ConclusionTreg cells may be involved in the process of the pathogenesis of senile COPD and acute exacerbation.There is no correlation between the proportion of Treg cells and TGF-β1,and it indicates immune disorders may exist in senile COPD patients.

pulmonary disease,chronic obstructive;aged;CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells;transforming growth factor beta 1

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.025

黄芪(1979-)，硕士，主治医师，主要从事老年病学的研究。

R563

A

1671-8348(2015)29-4106-02

2015-04-13

2015-05-16)