EBV-CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EB病毒感染的分析*

缪晓娟，杨 慧，孙浩平，付 利，范方毅，王 译，何光翠，赖思含，侯严堂，李业成，易 海，苏 毅

(成都军区总医院血液科，成都 610083)

·经验交流·

EBV-CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EB病毒感染的分析*

缪晓娟，杨 慧，孙浩平，付 利，范方毅，王 译，何光翠，赖思含，侯严堂，李业成，易 海△，苏 毅

(成都军区总医院血液科，成都 610083)

目的研究EB病毒特异性细胞毒T淋巴细胞(EBV-CTL)治疗异基因造血干细胞移植后难治性EBV感染的疗效。方法报道4例EBV-CTL治疗异基因造血干细胞移植后难治性EBV感染病例并结合文献分析。结果3例取得了较好疗效，分别于治疗后1、2、3个月转阴，分别随访8、12、6个月未复发，仅有1例在EBV-DNA转阴后第6个月复发，再次EBV-CTL治疗后，迅速进展为移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)，治疗无效死亡。结论EBV-CTL是治疗难治性EBV感染的一种有效手段，但仍有部分病例治疗无效，值得进一步探讨和研究。

疱疹病毒4型，人；特异性细胞毒T淋巴细胞；异基因造血干细胞移植

EB病毒(EBV)感染是异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后常见并发症，通常采用减停免疫抑制剂、抗病毒药物和CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)治疗，部分病例病情可以得到有效控制，但仍有部分病例病情进展，成为难治性EBV感染，甚至可发展成移植后淋巴细胞增殖性疾病(post-transplantlymphoproliferativedisease，PTLD)[1]。因此，如何治疗常规治疗无效的难治性EBV感染仍是亟待解决的问题。近年来EBV特异性细胞毒T淋巴细胞(EBV-CTL)为这一感染提供了新的治疗手段[2]。本文采用EBV-CTL治疗4例allo-HSCT后难治性EBV感染，获得了较好的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年1月至2014年12月共4例患者，其中男1例，女3例；平均年龄(14.0±11.6)岁；1例再生障碍性贫血，2例复发难治急性髓系白血病，1例复发难治急性淋巴细胞白血病。

1.2 EBV-CTL的制备方法 主要试剂与仪器：RPMI1640细胞培养基、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素(rhIL)4、rhIL-7、rhIL-12、rhIL-15购于PEPROTECH公司，rhIL-2购于江苏金丝利公司，淋巴分离液(Ficoll1.077)购于天津斯坦姆生物科技有限公司，PepMix.EBV购于JPT公司，PGE2购于SIGMA公司，血细胞分离机购于费森尤斯公司。制备方法：(1)常规使用血细胞分离机分离血细胞悬液。(2)将分离好的血细胞悬液与生理盐水按照1∶1等量混匀，2 000 r/min离心15 min，弃去上清液。(3)抽取适量淋巴分离液(Ficoll1.077)，将弃去上清液的细胞液与生理盐水按照1∶1等量混匀，再缓缓加入Ficoll上层，2 000 r/min离心20 min。(4)弃上清液，收集PBMC层液至离心管中，加入生理盐水30 mL混匀，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，重复3次后计数。(5)用RPMI1640完全培养基重悬细胞于75 cm2培养瓶，放置37 ℃，5% CO2孵箱内培养24 h，将悬浮细胞(制备CTL)与贴壁细胞(制备DC)分开培养，悬浮细胞内加入rhIL-2、rhIL-15、rhIL-7、rhIL-12，贴壁细胞内加入GM-CSF、rhIL-4。D6：DC内加入PGE2，D7：DC内加入Pepmix.EBV，4 h后加入CTL中并继续培养3～5 d，后收集细胞，台盼蓝染色，并做流式检测，输注前常规进行微生物学送检，确保无污染后输注患者。

1.3 EBV-CTL输注 输注CTL前给予地塞米松2.5 mg静推；EBV-CTL输注总量为(5.0～11.5)×106/kg，输注时间为0.5 h，共4 d，1次/月。

1.4 患者随访 监测EBV-DNA定量(通过实时荧光定量PCR方法检测外周血EBV-DNA，拷贝数小于103为阴性)，1次/2周。

2 结 果

2.1 EBV-CTL制备产品的检测 采用流式分析所得EBV-CTL CD3+细胞中位数为92.9%(88.4%～94.6%)，其中CD8+细胞占83.6%(76.5%～95.2%)，CD4+细胞占8.8%(2.6%～11.7%)，而CD56+的NK细胞占6.3%(3.2%～10.9%)，CD19+的B细胞占0.4%(0.2%～0.8%)。

2.2 治疗结果 病例1，女，7岁。诊断：重型再生障碍性贫血。移植前外周血EBV情况：阴性。预处理方案：氟达拉滨+ATG+环磷酰胺。移植方式：母供女(7/10)半相合allo-HSCT。移植后给予常规口服环孢素预防移植物抗宿主病(GVHD)。84 d后，患者出现反复低热，体温38 ℃左右，伴咳嗽咳痰，外周血查EBV-DNA定量：4.23×104copy/mL，考虑移植后EBV感染。立即将环孢素减量，给予阿昔洛韦200 mg 8 h 1次静脉滴注及人免疫球蛋白5 g 每周1次静脉滴注，2周后无好转，给予利妥昔单抗(美罗华)100 mg静脉滴注 1次/周，4周后患者仍间断低热，咳嗽咳痰症状无明显好转，复查EBV-DNA进行性升高至2.35×105copy/mL。考虑为难治性EBV感染，给予EBV-CTL治疗1次/月，输注1次后患者体温基本恢复正常，咳嗽咳痰基本缓解，EBV-DNA明显下降，输注第2次后，EBV-DNA转为阴性。该例患者随访13个月，EBV-DNA始终为阴性。

病例2，女，31岁。诊断：复发难治性急性髓系白血病(M5型)。移植前外周血EBV情况：阴性。预处理方案：白消安+环磷酰胺+氟达拉滨+ATG。移植方式：父供女(5/10)半相合allo-HSCT。移植后给予口服环孢素预防GVHD，出现血压升高、伴眼痛及头痛，故改用他克莫司口服预防GVHD。56 d之后，外周血查EBV-DNA：2.22×103copy/mL。将他克莫司减量，给与阿昔洛韦350 mg 8 h 1次静脉滴注及人免疫球蛋白10 g 1次周静脉滴注，2周后EBV-DNA进行性升高，故给予美罗华500 mg静脉滴注1次/周，4周后复查EBV-DNA进行性升高至7.84×103copy/mL。考虑为难治性EBV感染，给予EBV-CTL治疗1次/月，输注1次后EBV-DNA转为阴性。该例患者随访至今已8个月，EBV-DNA始终为阴性。

病例3，男，12岁。诊断：复发难治性急性淋巴细胞白血病(L2型)。移植前外周血EBV情况：阴性。预处理方案：白消安+环磷酰胺+氟达拉滨+ATG。移植方式：父供子(6/10)半相合allo-HSCT。移植后给予口服环孢素预防GVHD。34 d之后，患儿出现发热，体温39 ℃左右，伴咳嗽咳痰、呼吸困难，EBV-DNA定量：1.52×105copy/mL。肺CT提示双肺弥漫磨玻璃样改变，考虑移植后EBV感染。立即停用环孢素，给予膦甲酸钠300 mg 1/天静脉滴注及人免疫球蛋白10 g 1次/周静脉滴注，2周后患者体温无明显下降，呼吸困难进行性加重，复查EBV-DNA定量：7.81×105copy/mL。给予美罗华400 mg静脉滴注1次/周，4周后患者体温仍无明显下降，呼吸困难进行性加重，复查EBV-DNA进行性升高至1.42×106copy/mL。考虑为难治性EBV感染，给予EBV-CTL治疗1次/月，输注2次后患者体温逐渐恢复正常，呼吸困难症状逐渐缓解。输注第4次后EBV-DNA转为阴性。该例患者随访至第10个月时，再次出现发热，体温38 ℃左右，伴咳嗽咳痰，EBV-DNA 6.20×105copy/mL。考虑EBV感染复发。再次给予EBV-CTL治疗2次后，患者体温及呼吸道症状进行性加重，且出现双侧颈部及腋窝淋巴结无痛性肿大，大者约2 cm×3 cm，疾病进展为PTLD。给予美罗华联合EBV-CTL治疗后，患者病情继续进展，最终因多器官功能衰竭死亡。

图1 4例患者输注EBV-CTL后外周血EBV-DNA变化曲线

病例4，女，6岁。诊断：复发难治性急性髓系白血病(M2型)。移植前外周血EBV情况：阴性。预处理方案：白消安+环磷酰胺+氟达拉滨+ATG。移植方式：非血缘全相合allo-HSCT。移植后静滴环孢素预防GVHD，患者出现抽搐、失语、意识短暂丧失，考虑环孢素所致，改用他克莫司小剂量口服预防GVHD。23 d之后，患儿低热，颈部可触及数个黄豆大串珠样排列状肿大淋巴结。EBV-DNA：5.23×103copy/mL。外周血(流式法)PTLD筛查：B细胞占有核细胞2.28%，Kappa/Lambda比值偏高，其中0.46%(占有核细胞)可疑为单克隆B细胞。考虑：(1)EBV感染；(2)PTLD可疑。立即停用他克莫司，给予阿昔洛韦200 mg 1/8 h及人免疫球蛋白10 g 1次/周抗病毒治疗，2周后无明显好转，给予美罗华100 mg静脉滴注1次/周，4周后，患儿仍偶有低热，伴咳嗽咳痰，颈部淋巴结无明显缩小，复查EBV-DNA进行性升高至2.34×105copy/mL。给予EBV-CTL治疗1次后，患儿体温恢复正常，EBV-DNA下降，治疗3次后，患儿颈部淋巴结缩小，EBV-DNA转阴。该病例随访至今已6个月，EBV-DNA始终为阴性。

4例患者使用EBV-CTL治疗后的EBV-DNA具体变化见图1。

3 讨 论

EBV感染是allo-HSCT后特别是接受T细胞去除移植物或免疫重建延迟的患者常见并发症之一。van Esser等[3]报道EBV再激活发生率在非去除T细胞的移植患者中为31.0%，而在去除T细胞移植的患者中为65.0%。曹新辉等[4]报道allo-HSCT后EBV再激活的累积发生率42.27%，EBV再激活发生的危险因素有HLA配型不合、应用抗胸腺细胞球蛋白、Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病及年龄小于20岁。

根据2008年欧洲移植-感染会议制定的指南定义：在血液中检测出EBV-DNA，且无临床症状的患者可诊断为EBV血症。部分EBV感染的患者最终可发展成严重致死性疾病PTLD，死亡率极高。PTLD最常见的临床表现是发热、淋巴结肿大，其他还包括肝脾肿大、咽炎及中枢神经系统症状等。

EBV感染主要治疗措施有：(1)免疫抑制剂减量，是治疗EBV血症的首选方法。而对于HSCT后EBV感染患者，因为免疫功能尚未重建，减停免疫抑制剂并不能恢复T细胞功能，并有可能诱发严重GVHD[1,5]。(2)抗病毒治疗，但抗病毒药物是否能够降低PTLD危险性并不确定。(3)抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)。PTLD患者B淋巴细胞稳定高表达CD20抗原，为单克隆抗体治疗提供理想靶点。美罗华常规剂量为375 mg/m2，每周1次，一般1个疗程不超过4次。大部分患者在接受利妥昔单抗治疗后，血液中EBV-DNA定量水平可出现大幅下降。Milpied等[6]报道，应用美罗华治疗32例PTLD患者，患者年龄3～67岁：20例患者取得了完全缓解，2例取得部分缓解，有效率达68.75%；其中6例骨髓移植患者中5例完全缓解，完全缓解率为83.00%。尽管利妥昔单抗具有良好的安全性，但它会导致B细胞6～8个月的缺乏以及一些未知的长期的不良反应[7]。虽然罕见，使用利妥昔单抗导致CD20阴性淋巴瘤的复发已报道[8]。

EBV原发感染后，EBV潜伏于B细胞中，能启动细胞增殖程序，最终可发展为恶性增殖的淋巴组织。在正常人体内，T细胞可控制B细胞增殖从而阻止这一进程的发生。当感染EBV的宿主是已接受allo-HSCT的患者时，由于该类患者免疫功能低下，并缺乏有效的免疫监视，可导致EBV出现再激活，病毒大量复制，同时大量表达EBV相关基因，其中一些癌基因可引起B细胞异常增生，最终可能发展为PTLD[9-10]。而EBV-CTL通过过继细胞免疫，可重建T细胞免疫反应，不仅可直接清除受感染B淋巴细胞，抑制B淋巴细胞扩增治疗PTLD，还可以产生长期记忆效应，防止疾病复发。Bollard等[11]报道了一项为期7年的临床研究，56例患者年龄9个月至20岁，均行去T细胞HSCT，所有患者预防性输注了供者来源的EBV-CTL；输注CTL的中位时间为移植后88 d，其中26例输注的CTL标记有新霉素抵抗基因；56例患者均未发生PTLD，而对照组的PTLD发生率为11.50%；应用实时定量PCR方法检测，发现患者外周血中新霉素抵抗基因持续时间最短为69个月；有3例因不适合预防性输注而发展为PTLD的患者，接受了EBV-CTL输注治疗，2例患者病情得以缓解，治疗无效的患者淋巴瘤细胞中发现了抗原逃逸变异。Heslop等[12]进行的一项单中心研究中，114例患者在接受HSCT后使用供者来源的EBV-CTL进行预防或治疗PTLD，结果显示，所有患者均可很好地耐受治疗，无一例患者在输注淋巴细胞后发生GVHD。其中101例血清EBV-DNA阳性的患者，最终没有发展为PTLD，而11例疑似PTLD患者治疗后均达到完全缓解，并且无复发。

结合本研究这4个病例，发生EB病毒感染后，先后给予了抗病毒药物、人免疫球蛋白、利妥昔单抗(美罗华)治疗，均未取得疗效，发展成难治性EBV感染。给予EBV-CTL后，4例患者中，其中3例取得了较好疗效，仅有1例患者在EBV-DNA转阴后第6个月复发，在EBV-CTL治疗后，迅速进展为PTLD治疗无效死亡。4例患者无一例出现治疗相关不良反应或GVHD。

综上所述，EBV-CTL是治疗常规治疗无效的EBV感染的一种有效手段，为难治性EBV感染提供了新的治疗策略。部分病例反应良好，但在长期随访过程中仍有部分病例EBV-DNA再次升高，再次给予美罗华及EBV-CTL治疗仍然无效，最终发展为PTLD，治疗无效死亡，说明EBV-CTL治疗移植后难治性EBV感染仍然有很多未解之谜。本研究虽然取得了一定疗效，但因病例数较少，后期仍需扩大病例数量，对该方法进行进一步探讨和研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.007

成都军区总医院院管项目(2013YG-B045)。

：缪晓娟(1985-)，硕士，住院医师，主要从事血液方面的研究。△

，Tel:13699418229；E-mail:yihaimail@163.com。

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1671-8348(2015)29-4051-03

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