杨 辉 宗军君 薛向锋 侯智斌
(中国人民解放军陆军军官学院 合肥 230031)
生物战剂/气溶胶探测和识别系统综述*
杨 辉 宗军君 薛向锋 侯智斌
(中国人民解放军陆军军官学院 合肥 230031)
生物战剂/武器具有针对性强(人体、动物或植物)、易于制造、廉价、探测困难、防护代价高、感染群体诊治困难等特性,对生物战剂的防御极具挑战性。论文对生物气溶胶/生物战剂探测识别系统的技术路线(如物理、分子、免疫及配合基检验等)、特点和运用情况进行了分析梳理和总结。
生物战剂; 生物气溶胶; 探测; 识别
Class Number E835.8
人类使用生物战剂已有2500年的历史。生物战剂或生物武器包括微生物和生物毒素,可以致人、动物和植物疾病或死亡。生物战剂可以极小的经济代价、隐蔽地感染大面积的人员和其他生物,导致大规模的伤亡。对生物武器实施有效防护极为困难的原因包括探测复杂、防护代价高昂以及战剂的极强感染选择性等,感染后的初始症状也不易与常规感染区分开,不便于开展医学处理。
相对而言,生物探测技术远未达到化学探测技术的成熟水平。点式探测设备是目前最典型的生物气溶胶探测系统,大多处于外场测试或实验室研制阶段,体积大、结构复杂、价格昂贵、探测虚警率高、探测战剂种类少,且必须接触探测对象。利用DNA序列分子特性、抗原标识、质谱分析等进行精确的探测和识别理论上是可行的,远程遥测系统只能进行空间分布的探测,不能精确确定生物战剂的类别及浓度。因此,判定生物战剂性质、成份的传感器非常复杂,识别设备需特制的、受训过的鉴别器等。
生物战剂的探测和识别系统可被区分为不同的类别。如按移动能力分,可分为手持式便携式探测装备、移动实验室探测装备、成像设备、固定设施探测系统、远程遥测系统、生物采样仪和生物试剂盒等。根据探测识别原理,设备可分为分子识别技术(聚合酶链反应PCR,分子杂交和阵列技术)、免疫侦测技术(侧流免疫,电化学发光、酶联免疫吸附测定ELISA,时间分辩荧光、生物传感器),物理技术(流式细胞仪、光纤、采样准备、荧光、尺度和形状分析、质谱分析、毛细管电泳、高性能液相色谱法、火焰分光光度测定法、气相色谱法),配体小分子技术(表面等离子共振)、显微、标准细菌培养和混合设备技术等。
生物战剂是活体病原微生物以及相关的生物毒素,它们可以引发大规模的人类、动物和/或植物的感染和中毒。生物战剂根据诱发媒介的不同,可为分为细菌、病毒、立克次氏体和生物毒素。
生物战剂来源可分为几大类:自然源、农业和牲畜、医院环境及传染病、工业和其他来源等。生物气溶胶的自然来源包括植物孢子、细菌和真菌的病原体。农业气溶胶与自然气溶胶融合在一起,如人们在处理干草时吸入的气溶胶或灰尘,这些气溶胶或灰尘可能会含有感染啮齿动物的污物,在农业生产和谷物存储过程产生的真菌毒素,也会引发感染。微小液滴的疾病传播不仅仅局限在医院里,也能通过流感和病毒感染随处发生。工业生产过程和垃圾废物填埋也是生物气溶胶的重要来源,气溶胶的组分有致病微生物、毒素、过敏源及灰尘粒子等。大多数有毒和不健康气溶胶接触融合后会生成新的生物气溶胶。
生物战剂除主要用在战场上外,现在还可能被恐怖分子利用。生物战剂可被制成干泡沫剂或液态剂。相较于液态剂,干剂存储时间长,施放效率高,准备方便。生物战剂可通过空气、水和食物传播,也可通过与昆虫和啮齿动物的接触而感染。生物战剂最危险的传播方式是气溶胶形态的传播。考虑到诊断的困难程度,疾病潜伏期的不同,大范围的覆盖和传播途径,生物气溶胶是生物战剂最有效的传播形态。
生物战剂/气溶胶传播的数值建模和仿真研究对生物战剂的探测起着重要作用。在探测识别过程中必须确认微生物的活性,还必须加强对生物背景的了解。生物背景的分类和研究,要从四个方面入手,即它对人类的致病能力,作用频率,环境防御能力,以及治疗用的抗原抗体等。
气溶胶便于快速、有效地向大面积人群实施生物攻击,因此相较于皮肤接触、食品中毒和媒介传播,气溶胶形态是生物战剂的最佳传播方式。
大多探测和识别设备连接着一个采样器。采样设备可以捕捉液态或固态(如琼脂)的微粒,微粒的形态影响着下一步的分析方法,如显微观察、培养、生物测定、免疫学检测等[1~2]。影响微生物经采样恢复的因素有采样率、采样时间、粒子类型、尺寸及分布、浓度因子、环境因子(如涡流风)、探测方法、采样器选型(与采集和恢复效率,活性损失相关)等。在采样过程中,生物气溶胶的活性保持也非常重要。有三种生物气溶胶的采样方式:重力装置、撞击器和虹吸吸入式采样器。
重力采样法为被动式采样,它利用了覆膜粒子在显微镜载(物)片、琼脂板上的重力下降和惯性过程,由于不能定量和定性测量,这种方法使用受限。采样效率取决于粒子尺度、空气涡流、风速等。典型的有文岑茨采样器、瓦格纳采样器和利思采样器等。
撞击采样器通过使用电扇或旋转采集表面来加速空气,它适用于室内生物气溶胶的采集采样,如惯性撞击器、冲击式采样器、旋风分离器和离心采样器等。惯性撞击器使用一个风扇或虹吸负压源产生定速风速,并通过滤网来筛选粒子,一般地,粒子沉积到固态或半固态表面,粒子采集具有尺度选择性,典型代表有Sartorius MD8,Samplair MK2、Air ideal、Air samplair以及SAS等。冲击式撞击器利用了空气经过液体(如水、培养液、矿物油等)后的转变过程,这个过程中,粒子从空气中转换成了液相态,系统的不足体现在粒子的通过性、粒子碰撞、弹跳、液体蒸发及活性损失等方面,典型系统有AGI、SKC的生物采样仪等。旋风分离器和离心采样器使用涡流来产生足够的惯性,以将粒子沉积到采集面上,粒子经拦截后在液态(旋液)或半固态媒介(离心机)中重新生成。典型型号有:研究国际的SASS 2300和2400等。
虹吸吸入采样器包括狭隘采样器,级联撞击器和过滤组件等。虹吸采样器通过直接撞击细菌培养媒介,冲击液后续培养或过滤提留液来提取活性粒子,而非活性粒子可利用显微检查载物片检定出来。最初设计的孢子捕捉器用来捕捉真菌孢子和花粉。粒子通常被捕捉到覆膜玻璃载片上或胶带上,它的优点包括非选择性采样和采集后直接分析,缺点包括覆膜的掩蔽问题,不能判定活性等。典型系统有Hirst,Burkhard,Air-o-cell,Allergenco等。
聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)是重要的分子识别技术之一,主要用于临床实验,以便进行微生物的鉴别。PCR可以将单个或几个DNA片断拷贝成指数倍地放大,还可对特定DNA序列建立起数千个拷贝。典型的PCR通过重复热、冷循环工作。由20~40的快速监测温度变化产生了循环系列,通常由2~3个分离的温度变化步骤组成。各个循环参数的选择取决于温度、时间长度,DNA合成所用的酶类型,二阶离子浓度,反应dNTP,以及引子的融点温度(Tm)等因素。
有数个基于PCR原理的小型手持设备适合于外场使用,它们的主要性能参数,在单次处理样品数上有较大差别(HANAA4个,Bio-SeeqTMPlus6个,RAPID8个),而在探测速度和响应速度方面则差异较小。史密斯探测公司生产的Bio-SeeqTMPlus采用了指数叠加线性聚合酶链反应,即LATE-PCRTM技术。艾达荷科技生产的先进加固病原体识别仪RAPID,基于实时荧光PCR(PT-PCR)平台上打造,它的另一个设备RAZOR则使用了切边技术,以便于外场使用;劳伦斯利弗莫尔国家实验在1999年制成的手持式先进核酸分析仪,可以分析生物样本,并进一步确定特定DNA序列的存在与否[3~6]。
除此之外,还有其他类型的PCR,如变星公司出品的SmartCycler®和GeneXpert系统,罗切应用科学出品的COBAS AMPLICORTM分析仪和LightCyclerTM,两者作为大型系统的组件,可用于移动实验室。
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法基于特定抗体和抗原的相互作用,即基于固相载体表面上抗原和样本内抗原的竞争作用。两种抗原在抗体上的有限结合位点上相互竞争。样本内分析的抗原越多,结合到锚定抗原上的抗体越少。去掉自由物质,针对位点抗体,加入标有二次抗体的酶,后续反应产生可探测信号,用常用颜色标识。
克隆戴格出品的ArrayTube芯片[7~8]集成了微管集成蛋白质芯片和经典夹心-酶联免疫吸附测定过程,该过程应用色度着色技术实现了可视化,着色技术采用与目标分子共轭的(辣根过氧化物酶,HRP)分子,而目标分子又被绑定至AT-阵列来催化四甲基苯醌的局部沉淀反应。最终的沉淀模式图像可用ArrayTube阅读器来进行探测。
美国海军研究实验室出品的Array生物传感器系统[9]使用了夹心法和CCD相机来探测生物战剂。在对不同的战剂使用捕捉抗体和跟踪抗体后,它可在同一个载玻片上同时探测和识别不同的目标战剂,其响应快速(10~15分),灵敏度高、选择性强。
史密斯探测公司出品的生物探测器,在分子设备的辅助下,运用免疫配体测定化学和一个光寻址电位传感器,可以同时探测多达8个不同生物战剂。在免疫特定反应期间,生物毒素和荧光标识抗体与抗荧光抗体(共轭酶脲酶)要同时使用。在探测阶段,脲酶的酶反应底物(酶作用物)会改变PH值,PH的改变则由LAPS变换器进行探测。该公司出品的灵巧生物传感器系统采用了8个传感器阵列,其样本被存储起来以备下一步分析。研究国际公司出品的RAPTOR是一个便携式、自动化的4通道荧光免疫分析系统,可以快速探测蛋白质毒素,病毒和细菌[10~11]。研究国际公司和海军研究实验室联合出品的Analyte 2000,则是一个4通道的单波长荧光计,它运用衰逝波荧光免疫分析技术来探测生化物质。
荧光空气动力学粒谱仪(Fluorescent aerodynamic particle sizer,FLAPS)对每个粒子进行同步测量,两个不同波长上的散射光强度及荧光辐射,分别用两个高灵敏度光电倍增管进行采集。紫外空气动力学粒谱仪(UV-APS)是FLAPS粒谱仪的一个变种,它运用飞行时间粒径测量、光散射和紫外荧光强度来对大气样本中的生物战剂进行非定性测量。TSI公司已推出了FLAPS和UVAPS的商业产品[12~14]。
由海军研究实验室出品的单粒子荧光计数器[15],对粒子受266nm激光激励后辐射出的紫外荧光强度进行测量。拜拉尔公司出品的VeroTect[16]则结合了空气动力学粒谱测量技术和粒子荧光谱技术,可以测量粒径、形状几何参数,并利用280nm波长的激励激光来测量荧光的强度,利用测得的激光诱导荧光和几何(粒径、形状)参数,VeroTect可获得其他任何设备不能给出的气溶胶特征。
6.1 荧光法
荧光法运用了生物材料中的分子荧光特性(通常在紫外区)。受激成分自发返回到基态后即会辐射出不同波长的激光。不同设备间的差异主要表现在光源、激发波长、测量通道数等参数方面。
6.2 毛细管电泳技术
毛细管电泳是一种解析技术,它根据离子电泳淌度(迁移率)的不同,采用外加电压来分离离子。电泳淌度取决于分子电荷、黏性及原子半径等。由于结果迅速、分辩率高,所以毛细管电泳的使用占了主导地位。典型产品如安捷伦科技出品的2100生物分析仪。毛细管电泳技术必须与其他技术体系的仪器设备(特别是质谱仪)配合使用来探测识别生物战剂气溶胶。
6.3 流式细胞仪/测量术
流式细胞仪利用悬浮样品细胞光学特性的区别,可以准确区分并确定它们的数量。该方法允许生物粒子在穿过激光束时,同步地测量和分析它们的物理化学参数。激光束穿过粒子后产生了光折射和散射,折射根据折射方向和角度的不同可分为直接散射-前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)。FSC与粒子体积与相关而SSC则由粒子的内部复杂度决定。与折射一样,光散射也通过荧光进行测量。与被分析粒子匹配的荧光染料吸收特定波长的光,在另一波长上产生辐射。使用流式细胞光度计时,吸收谱相同,但出射辐射不同。细胞和无细胞结构(细菌、病毒)并不含荧光片段,但它们可以用荧光基材进行标定,荧光基材与细菌、病毒的DNA相绑定。
BioDETECT AS出品的MICROCYTE® Field是一款商业化的坚固、便携式流式细胞仪,能在现场对潜在污染源或可疑材料进行探测和确认,对微生物进行分析,数据结果可使用两色柱状图或二维散点图来进行数据来呈现。
6.4 光学遥测技术
激光雷达作为遥测系统,用于在将战剂抵达其他分析设备前进行远程探测和识别生物战剂。激光不是用来采样,而是用于探测。短促激光脉冲在穿过大气时与路径上的大气分子、气溶胶、云和尘土相互作用后,可以识别远至30km~50km的粒子,但不能确定粒子的类型,比如,辩明是否是生物战剂。
总体上,激光雷达系统可以给出云物理信息(尺度、形状和相对湿度)和空间云位置(距离、宽度、高度、地面高和漂移速度),但不能识别出生物物质的性质。现有激光诱导荧光传感器包括洛克希德马丁出品的生物战剂预警传感器BAWS[17],SR-biospectra原型传感器,以及远距生物遥测探测系统LR-BSDS等。
生物战剂预警传感器BAWS是一个局地点式传感器,只能探测流经传感器的粒子,因此可被看成是一个近距激光雷达,激光器到被探测生物粒子的距离只有仅仅的几厘米。类似地,Biospectra也是一个紧凑型的生物威胁探测短距激光雷达。
6.5 光谱法
普罗引擎公司出品的生物预警监视器,工作原理采用的是火焰光谱学。采取连续工作方式,对大气中的生物粒子(主要是细菌和毒素)的特定化学结构进行搜索分析,当可疑粒子的浓度迅速上升时即迅速报警。它还可以启动一个生物采样器来判定所测粒子的病原体特征。2009年,普罗引擎公司和贝汀科技打造了一个原型机,它由三个生物探测系统组成:MAB、空气病原体探测生物-空气采样器和战地生物辨别器。法国陆军采购了该型设备用以执行海外任务。首次报警后,该系统能给出危险等级报警的时间为20min以内。
橡脊国家实验和轨道科学公司共同出品的生化质谱仪模块Ⅱ(CBMS block Ⅱ)[18],配备在侦察车和其他机动平台上,对生化战剂进行探测和识别。CBMS block Ⅱ由一个质谱仪模块、采样介入模块、采样模块和一个士兵显示终端组成。该探测系统采用了生物粒子直接采样和热(分)解作用等原理。它采用布鲁克达尔托尼克斯开发的软件平台bio profiler,运用MALDI-TOF质谱仪内嵌的蛋白质指纹,与数据库的峰值列表进行比对,来对微生物组织进行识别。
紫外空气动力学粒谱仪(UV-APSTM)[14],运用355nm波长紫外光激励后产生的420nm~757nm散射光,来测量光散射和飞行时间,进而测量出浓度及1μm~20μm区间的粒径。
傅里叶变换红外光谱仪是一个被动光学技术,用于采集固相、液相或气相态的红外吸收谱、发射谱、光电导性或拉曼散射特性,优点是可以在宽光谱范围内同步采集光谱数据。实验数据表明,采用可靠的识别算法,可以成功辨别背景材料和瓷土尘,其研究成果证明了FTIR探测生物气溶胶的可行性。
6.6 集成探测系统
集成探测系统通常由几个分系统组成。探测分系统响应速度快,可连接监测生物战剂粒子群的浓度廓线和结构。测量廓线的显著变化标明了生物战剂的存在,可立即启动报警或其他措施,启动采样设备进行性质判定等。
劳伦斯利弗莫尔国家实验室出品的biobriefcase[19]是一个集成、小型化气溶胶采集与分析系统,由三个部件组成:气溶胶采集模块、PCR模块和免疫测量分析模块。该探测器采用了毛细管电泳技术,PCR模块自动进行DNA提纯、浓缩和放大等步骤。系统可以连续30天不间断工作,因此可以用作被动监测手段。
间歇式生物战剂探测系统(IBAD)[20]是一个简易半自动驻点式探测系统,用在船(舰)载平台,由粒子计数器、粒子湿度旋风采样器和一个人工手持式免疫色谱检测鉴别器组成。
生物集成探测系统(BIDS)由五个子系统构成: 1) 车载平台; 2) 防护装置; 3) 辅助设备; 4) 电力供应; 5) 生物探测部件。测试设备包括TSI公司的高容积空气动力学粒度仪HVAPS、流体采集器、生物采样器或单液滴样本采集器、犁刀公司的流式细胞仪、分子设备公司的阈值工作站、生物探测器和质谱仪等。生物集成探测系统集成了空气动力粒径测量、发光、荧光、流式细胞测量、质谱测量和免疫测定技术等,并以多等级、多层级结构增强了探测可靠性。理论上,它可探测所有类型的生物战剂,并对特定战剂进行甄别和鉴别[15]。
联合生物点式探测系统JBPDS是一个全自动的生物探测和识别装备,它可以集成到车载、船舰或拖车等不同的平台中,也可以独立部署。它由探测器、采集器、流体控制子系统和鉴别器组成。鉴别器含有针对特定生物战剂抗原的抗体。JBPDS采集到和保存的样本为下一步的确认分析提供了基础。
加拿大通用动力出品的4WARN关键点生物探测系统,是一个第三代全自动生物战剂探测和识别系统,它设计灵活,允许用户根据任务的不同,车载/海上平台的不同,对其组件进行任意组合。该系统使用了荧光粒子探测和生物实时传感器技术。针对特定战剂的探测则使用抗体测定条及其自动阅读器,或多位点聚合酶链反应。系统与液体采样采集模块、一块电池和一个处理器控制单元相互耦合在一起。
劳伦斯利弗莫尔国家实验室出品的自动化病原体探测系统APDS[21~22],用于对大气中的病原体和毒素进行连续采样。可以无人值守工作一星期。APDS使用被抗体包裹住的小珠来进行探测,其中抗体针对特定的目标。它由一个气溶胶采集器、一个样本准备子系统和两个探测分析子系统,一个运用了PCR原理,另一个采用了流式细胞测量原理,并使用抗体来识别病原体。
研究国际出品的biohawk[23],是一个集成了一个气溶胶采集器的便携式8通道生物测定系统,它利用一个信用卡大小的塑料检定切片来进行生物测定,在切片内,存放了全部确定目标试剂。
本文对生物战剂和生物气溶胶的探测和识别原理方法和设备现状进行了梳理。多家公司出品的设备已经运行在一些潜在的危险地点,如机场、地铁、体育场、政府大楼和半封闭设施等。部分集成探测系统和光学设备可用于军事用途,一些设备目前只能用在实验室,或进行快速扫描测试(如手持式系统)。各探测系统信息及其相关应用可在所属网站上查询。
生物战剂探测的趋势是更高效、操作更方便、小型化和简便化。除手持设备外,其他设备需要对操作人员进行特殊培训,如大型复杂系统4WARN。对样本的探测识别,如采样、浓度演算、性质判定等目前所需时间较长。
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Detection and Identification System of Biological Aerosols
YANG Hui ZONG Junjun XUE Xiangfeng HOU Zhibin
(Army Officer Academy, Hefei 230031)
Easy and inexpensive manufacturing of biological weapons, complicated detection, expensive protection, difficult treating of affected individuals, selective impact only for people, animals or plants, are all factors making an effective defense against biological warfare agents. The aim of this study is to introduce the systems for the detection and identification of biological aerosols containing dangerous bioagents. The basic techniques used for detection and identification of bioagents are described, including physical, molecular, immunochemical, and other ligand assays. Measuring systems and equipment for the individual techniques are summarized.
biological warfare agents, biological aerosols, detection, identification
2014年7月5日,
2014年8月25日 基金项目:国家自然科学基金项目(编号:41375026)资助。
杨辉,男,博士,副教授,研究方向:激光雷达研制和大气环境监测、光电子技术、嵌入式系统、移动计算等。
E835.8
10.3969/j.issn1672-9730.2015.01.005