藏药仁青常觉联合环磷酰胺治疗白血病的实验研究

吴洪革 邵成雷 付素心

【摘 要】 目的：观察藏药仁青常觉对抗肿瘤化疗所致的免疫抑制。方法：通过仁青常觉联合环磷酰胺治疗L615白血病小鼠、P388白血病小鼠的药效学实验研究，比较各实验组IL-2、IL-6、IFN-γ、NKC等细胞因子的变化。结果：仁青常觉可以调节T细胞亚群比例及促进IL-2、IL-6、IFN-γ、NKC等细胞因子的分泌，且呈浓度依赖性。结论：仁青常觉与化疗药物同用，能提高机体免疫，有助于化疗的完成。

【关键词】 仁青常觉;环磷酰胺;白血病;实验研究

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）15-0021-03

Experimental study of Renqingchangjue combined with cyclophosphamide on treatment for leukemia

WU Hong-ge1 SHAO Cheng-lei2 FU Su-xin2

（1.The hospital of Zichuan District in zibo，ShanDong Province ，zibo 255100， china;

2.Shandong Arura Medicine Research And Develop Corportion， ShanDong Province ， Jinan 250101， china）

Abstract：Objective to observe Renqingchangjue against chemotherapy-induced immune suppression. Methods Through experimental studies of Renqingchangjue in combination with cyclophosphamide on L615 leukemia mice and P388 leukemia mice ，comparing cytokines changes of IL-2、IL-6、IFN-γ、NKC. Results Renqingchangjue can regulate the percentage of T cell subgroup and promote the secretion of cytokines such as IL - 2， IL - 6， IFN - gamma， NKC， etc. Conclusion Renqingchangjue combined with chemotherapy drugs，can improve the body immunity，helps chemotherapy completed.

Keywords：Renqingchangjue; cyclophosphamide; leukemia; Experimental study

仁青常觉系藏族验方，成方于公元八世纪，具有一千多年的应用历史，现收载于《中国药典》（2010版）一部。仁青常觉依据藏医药学原理，由珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、诃子、牛黄、人工麝香、西红花等精选的160余味纯天然、珍贵、稀有藏药材组成，有“百病一药”、“药之珍宝”等美称。临床上广泛用于肿瘤、胃肠溃疡、各种中毒症、缺铁性贫血等，特别对萎缩性胃炎、久治不愈的顽固性疾病等有特殊疗效。能提高机体免疫力和抗应激能力，减轻放化疗的毒副反应[1]。本文通过环磷酰胺联用仁青常觉治疗L615白血病小鼠、P388白血病小鼠的药效学实验，观察仁青常觉对抗肿瘤化疗所致的免疫抑制，对有效保证化疗的完成，具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种一级小鼠，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，雌雄各半，体重18～22g，合格证号：SCXK（鲁）20080002。

1.1.2 主要试剂和药品 环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产;标准重组人白介素-2（北京双鹭药业股份有限公司生产）;Yackl及IL-2依赖细胞株CTLL（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心提供）;RPMII640细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司生产）;四甲基偶氮唑盐（MTT）、十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白、二甲基甲酰胺均为Sigma公司生产;仁青常觉（金诃藏药股份有限公司生产）。

1.1.3 仪器 加样器、CO2培养箱、ELX-800酶标仪，均由美国Bio-Tek公司生产;96孔平底细胞培养板、Epics流式细胞仪，由美国Beckman公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 仁青常觉联合环磷酰胺对L615白血病小鼠的影响 取健康昆明种小鼠120只，雌雄各半，按体重随机分为6组，每组20只，即正常对照组、模型对照组、化疗组、化疗加仁青常觉低剂量组、化疗加仁青常觉中剂量组、化疗加仁青常觉高剂量组。除正常对照组外，各组小鼠接种L615白血病细胞0.2ml（在无菌条件下取L615白血病小鼠脾制成25%生理盐水细胞悬液，小鼠皮下接种），于接种后第3d给药，化疗组腹腔注射环磷酰胺200mg/（kg·d）;化疗加仁青常觉低剂量组、化疗加仁青常觉中剂量组和化疗加仁青常觉高剂量组除注射环磷酰胺外，分别灌胃给予仁青常觉75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg，上、下午各1次;正常对照组和模型对照组腹腔注射生理盐水0.2ml/（只·d），同时上、下午各灌胃相同体积的生理盐水。于第5天每组取10只动物处死，取脾脏匀浆，流式细胞仪测定T细胞亚群，酶联免疫法测定IL-2，IL-6，IFN-γ活性，余下各动物进行生存期观察。

1.2.2 仁青常觉联合环磷酰胺对P388白血病小鼠的影响 取健康昆明种小鼠48只，接体重随机分为6组，每组8只，即正常对照组、模型对照组、化疗组、化疗加仁青常觉低剂量组、化疗加仁青常觉中剂量组、化疗加仁青常觉高剂量组。除正常对照组外，各组小鼠接种P388淋巴细胞白血病瘤株（接种方法[2]：取腹水型P388白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为1.5×107个/ml，每只小鼠右腋下注射0.2ml）。化疗组腹腔注射环磷酰胺35mg/（kg·d），连续6d;化疗加仁青常觉低剂量组、化疗加仁青常觉中剂量组、化疗加仁青常觉高剂量组除注射环磷酰胺外，分别灌胃给予仁青常觉150mg/kg、300mg/kg、600mg/kg，连续灌胃给药14d;正常对照组和模型对照组给予相同体积的生理盐水。于第15天脱颈椎处死，在无菌条件下取脾脏，匀浆，测定NKC、IL-2活性。

1.2.3 统计学方法 计量资料以均数±标准差（x±s），以P<0.05为差异具有统计学意义表示，数据呈正态分布时进行单因素方差分析，不呈正态分布采用非参数检验。

2 结果

2.1 仁青常觉联合环磷酰胺对L615白血病小鼠的影响

2.1.1 对生存期的影响 实验结果表明，与模型对照组比较，化疗加仁青常觉低、中、高剂量组生存期明显延长，差异具统计学意义（P<0.05）;与化疗组比较，化疗加仁青常觉低、中、高剂量组生存期亦明显延长，差异具统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

2.1.2 对T细胞亚群的影响 实验结果表明，与模型对照组比较，化疗加仁青常觉低、中、高剂量组CD3+、CD4+明显增加，CD8+明显减少，CD4/CD8比值明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）;与化疗组比较，化疗加仁青常觉低、中、高剂量组亦表现出CD3+、CD4+明显增加，CD8+明显减少，CD4/CD8比值明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

2.1.3 对IL-2，IL-6，IFN-γ活性的影响 与模型组比较，化疗加仁青常觉低、中、高剂量组IL-6、IFN-γ明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）;与化疗组比较，化疗加仁青常觉低、中、高剂量组IL-2、IL-6、IFN-γ明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05），结果见表3。

2.2 仁青常觉联合环磷酰胺对P388白血病小鼠的影响 实验结果表明，与模型组比较，化疗组NKC及IL-2活性明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）;与化疗组比较，化疗加仁青常觉中、高剂量组IL-2活性明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果见表4

3 讨论

免疫功能的正常与否是肿瘤发生发展的重要因素之一，而免疫功能是通过免疫细胞所分泌的细胞因子所执行的。NKC是三大类淋巴细胞之一，是一群广谱抗肿瘤细胞，能迅速分泌大量细胞因子如干扰素-γ （IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、粒单细胞集落刺激因子（GMCSF）、IL-2等，调节吞噬细胞及T、B细胞功能。IL -2是机体内最主要、最强有力的T细胞生长因子，可诱导或促进多种细胞毒性细胞的活性，如NKC、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等，这些细胞在机体的免疫监视和抗肿瘤免疫方面至关重要[3]。

白血病小鼠化疗后T细胞亚群比例失调，NKC，IL-2，IL-6，IFN-γ等细胞因子分泌水平下降。本研究显示通过使用仁青常觉治疗后，T细胞亚群比例恢复正常，NKC，IL-2，IL-6，IFN-γ等细胞因子分泌水平回升，说明仁青常觉可通过调节T细胞亚群比例及促进细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，对于防治肿瘤化疗所致的免疫抑制，有效保证化疗的完成，具有积极的意义。

参考文献

[1]国家药典委员会. 《中国药典》[S].2010年版.中国医药科技出版社，2010：573.

[2]王四旺，施新猷，黄传贵，等. 中药药效学研究与评价[M].西安：陕西科学技术出版社，2005：719-721.

[3]李偶，田卫卫. 补肾益气冲剂对P388白血病小鼠化疗后自然杀伤细胞、白介素-2活性的影响[J].成都中医药大学学报，2001，2 （1）：40-41.

（收稿日期：2014.05.20）