HPLC法测定清热凉血软膏中大黄素、大黄酚的含量

丁科+吕焰+朱涛

【摘 要】 目的：建立清热凉血软膏中大黄素、大黄酚的含量测定方法。方法：高效液相色谱法。色谱柱：Dionex Ultimate 3000-C18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：甲醇-0.1%磷酸（80∶20）;检测波长：254nm;流速：1.0ml/min。结果：大黄素在0.010～0.200μg/ml范围内线性良好，回归方程为Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），平均加样回收率为100.33%，RSD为1.743% （n=5）;大黄酚在0.020～0.400μg/ml范围内线形良好，回归方程为Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），平均加样回收率为100.253%，RSD为1.942% （n=5）。结论：本方法操作简便快速、灵敏度高、重现性好，可以用于清热凉血软膏的质量控制。

【关键词】 清热凉血软膏;大黄素;大黄酚;高效液相色谱法

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）15-0012-02

Determination of the Contents of Emodin and Chrysophonl in Qingreliangxue Ointment by HPLC

DING Ke，LV Yan， ZHU Tao

Department of Chinese Pharmacy，The First Affiliated hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China

Abstract：Objective To establish a HPLC method to determinate the contents of Emodin and Chrysophanol in Qingreliangxue Ointment. Methods The analysis was used on a Dionex Ultimate 3000-C18（4.6mm×150mm，5μm）;methanol-0.1%H3PO4（80∶20） as mobile phase; the flow rate was 1.0mL/min;the detection wavelength was 254 nm. Results A good linearity can be found in the range of 0.010～0.200μg （r=0.9999） in Emodin，the average recovery rate was 100.33%，RSD was1.743%（n=5）;the linear ranges of chrysohonl at 0.020～0.400μg （r=0.9999），the average recovery rate was 100.253%，RSD was 1.942%（n=5）.Conclusion This method is reliable， rapid and accurate. It can be used to control the quality of Qingreliangxue Ointment.

Keywords：Qingreliangxue Ointment; Emodin;Chrysophanol; HPLC

清热凉血软膏（以下简称“清凉膏”）主要由大黄、当、紫草等中药组成，具有清热解毒、消肿止痛、活血散淤等功效，临床适用于跌打损伤，关节肿痛，丹毒疱疹，特异性炎症等病症，是浙江省中医院传统中药软膏（浙准制字20100233）。清凉膏前期临床观察发现，含有大黄成分的制剂比未含有大黄成分的中间体要产生更加明显的药理活性，故本文对清凉膏采用高效液相色谱法，测定其中主要成分大黄素、大黄酚的含量，并建立一种快速、灵敏、准确的质量检测方法，并为以后制剂改良研发提供理论依据和技术参考。

1 仪器与试剂

Inertsil ODS-SP高效液相色谱系统（美国Thermo Fisher）;KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;IKA旋转蒸发仪/DLSB-5低温冷却循环泵（德国Digital）。大黄素（批号：110756-201110）、大黄酚对照品（批号：110796-201118）均由中国药品生物制品检定所提供;清热凉血软膏（批号：121217，130109，130110，1320226，130305，浙江省中医院）。甲醇（色谱纯，美国Tedia）;重蒸水;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Dionex Ultimate 3000-C18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：甲醇-0.1%磷酸（80∶20）;检测波长：254nm;流速：1.0ml/min;柱温 25℃;进样量10μl。在本实验条件下，大黄素、大黄酚与其他组分分离完全，分离度R>1.5，理论塔板数以大黄素峰计不低于5000。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取大黄素、大黄酚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含大黄酸、大黄素各30μg;分别精密量取大黄素对照品溶液1ml，大黄酚对照品溶液2ml，混匀，即得（每1ml含大黄素10μg，大黄酚20μg）混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的清热凉血软膏2g，置50ml锥形瓶中，加入甲醇25ml称定重量，加热回流30min，放冷，冷水浴冷却并用甲醇补足减失重量;精密量取滤液5mL置50ml锥形瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/l硫酸溶液10ml，超声处理5min，再加氯仿10ml加热回流1h，置分液漏斗，并用少量氯仿洗涤，并入分液漏斗，酸液用氯仿提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压挥发溶剂至干，取残渣，精密加甲醇10ml，溶解，取续滤液得供试品溶液。endprint

2.2.3 缺大黄阴性对照溶液的制备 取未加入大黄粉前的清凉膏中间体，按供试品溶液的制备方法制成缺大黄阴性对照品溶液。

2.3 前处理工艺的考察 分别考察加热回流和超声震荡两种提取方法，两者所测结果接近，加热回流法操作简便耗时长，超声提取耗时短对仪器操作要求较高;考察提取时间因素的影响，20min、30min、1h、2h提取后测定结果，其中30min处理后测定结果开始稳定;对同批样品以常温，加热，冰水浴冷却[1、2]进行提取处理，发现以冰水浴处理后含量测定明显高于其他方法，且结果重复性较好;本文参考《中国药典》2010版（一部）大黄药材测定的流动相体系[3]，在流动相中添加少量酸可以使色谱峰基线分离并峰形对称，考察了盐酸和硫酸并通过调整流动相的配比，使大黄素、大黄酚的分离度、拖尾因子等符合系统适应性试验的要求，最终确定最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（80∶20），以2.5mol/l硫酸溶液为酸性添加剂[4]。

2.4 空白试验 取大黄素、大黄酚对照品溶液、清凉膏供试品溶液及缺大黄的阴性对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样10μl（图1）。结果表明：对照品溶液和清凉膏供试品溶液色谱图在保留时间10、15min出现大黄素、大黄酚的色谱峰;缺大黄阴性对照品溶液色谱图在相同保留时间无色谱峰，说明其他成分对测定无干扰。

2.5 线性关系考察 精密称取大黄素、大黄酚混合对照溶液（每1ml含大黄素10μg，大黄酚20μg），吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色谱仪，在254nm测定大黄素、大黄酚的峰面积。以对照品量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：大黄素Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），大黄素Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），结果表明大黄素在0.010～0.200μg/ml、大黄酚在0.020～0.400μg/ml呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密称取混合对照品溶液10μl，按上述色谱条件连续重复进样6次测量峰值，结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一批号供试品溶液（130110），按上述供试溶液测定方法，分别于0，1，2，4，12小时进样10μl测定，结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为2.25%、0.13%，表明样品溶液在12h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批号清凉膏（130110）5份，按上述供试溶液制备和测定方法，进样 10μl测定，结果显示大黄素的平均含量为0.0282mg/g，RSD为1.91%;大黄酚的平均含量为0.0788mg/g，RSD为2.16%，表明重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的清凉膏样品1.0g（批号130110），分别加入每1ml含大黄素10μg、大黄酚20μg的对照品溶液15ml，按上述供试溶液制备和测定方法平行测试5份，计算加样回收率，结果见表1、2。大黄素的加样回收率在98.26%～102.33%之间，平均回收率为100.33%，RSD为1.743%;大黄酚的加样回收率在98.33～102.96%之间，平均回收率为100.252%，RSD为1.942%。

2.10 样品的含量测定 取不同的5个批号干燥至恒重的清凉膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色谱条件下进行测定，每个样品平行测定3次，计算样品中大黄素、大黄酚的含量，结果见表3。

3 讨论

清热凉血软膏为中药复方制剂，制样过程中其基质蜂蜡较难去除，本试验借鉴冰水浴冷却过滤的方法来排除干扰，取得良好效果。本文参照《中国药典》外用膏剂相关质量标准，采用高效液相色谱系统，以Dionex Ultimate 3000-C18为固定相，甲醇-0.1%磷酸（80∶20）为流动相，初步建立了清凉膏中主要指标成分大黄素、大黄酚的含量色谱测定方法。该方法与紫外分光法等其他方法相比较，检验先进，结果准确，重现性好，可优先用于清凉膏的质量控制。

参考文献

[1]郑艳春，杨冬丽，崔雅慧，等.HPLC测定新健胃包芯片中大黄素大黄酚含量[J].中国现代药物应用，2012，6（22）：127-129.

[2]尹华，盛云杰.HPLC测定六味安消胶囊中大黄素、大黄酚的含量[J].中医药学刊，2006，24（10）：1940-1942.

[3]国家药典委.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[4]陈志琦. HPLC测定益心康泰胶囊中大黄素大黄酚含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（10）：88-89.

（收稿日期：2014.06.08）endprint

2.2.3 缺大黄阴性对照溶液的制备 取未加入大黄粉前的清凉膏中间体，按供试品溶液的制备方法制成缺大黄阴性对照品溶液。

2.3 前处理工艺的考察 分别考察加热回流和超声震荡两种提取方法，两者所测结果接近，加热回流法操作简便耗时长，超声提取耗时短对仪器操作要求较高;考察提取时间因素的影响，20min、30min、1h、2h提取后测定结果，其中30min处理后测定结果开始稳定;对同批样品以常温，加热，冰水浴冷却[1、2]进行提取处理，发现以冰水浴处理后含量测定明显高于其他方法，且结果重复性较好;本文参考《中国药典》2010版（一部）大黄药材测定的流动相体系[3]，在流动相中添加少量酸可以使色谱峰基线分离并峰形对称，考察了盐酸和硫酸并通过调整流动相的配比，使大黄素、大黄酚的分离度、拖尾因子等符合系统适应性试验的要求，最终确定最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（80∶20），以2.5mol/l硫酸溶液为酸性添加剂[4]。

2.4 空白试验 取大黄素、大黄酚对照品溶液、清凉膏供试品溶液及缺大黄的阴性对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样10μl（图1）。结果表明：对照品溶液和清凉膏供试品溶液色谱图在保留时间10、15min出现大黄素、大黄酚的色谱峰;缺大黄阴性对照品溶液色谱图在相同保留时间无色谱峰，说明其他成分对测定无干扰。

2.5 线性关系考察 精密称取大黄素、大黄酚混合对照溶液（每1ml含大黄素10μg，大黄酚20μg），吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色谱仪，在254nm测定大黄素、大黄酚的峰面积。以对照品量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：大黄素Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），大黄素Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），结果表明大黄素在0.010～0.200μg/ml、大黄酚在0.020～0.400μg/ml呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密称取混合对照品溶液10μl，按上述色谱条件连续重复进样6次测量峰值，结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一批号供试品溶液（130110），按上述供试溶液测定方法，分别于0，1，2，4，12小时进样10μl测定，结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为2.25%、0.13%，表明样品溶液在12h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批号清凉膏（130110）5份，按上述供试溶液制备和测定方法，进样 10μl测定，结果显示大黄素的平均含量为0.0282mg/g，RSD为1.91%;大黄酚的平均含量为0.0788mg/g，RSD为2.16%，表明重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的清凉膏样品1.0g（批号130110），分别加入每1ml含大黄素10μg、大黄酚20μg的对照品溶液15ml，按上述供试溶液制备和测定方法平行测试5份，计算加样回收率，结果见表1、2。大黄素的加样回收率在98.26%～102.33%之间，平均回收率为100.33%，RSD为1.743%;大黄酚的加样回收率在98.33～102.96%之间，平均回收率为100.252%，RSD为1.942%。

2.10 样品的含量测定 取不同的5个批号干燥至恒重的清凉膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色谱条件下进行测定，每个样品平行测定3次，计算样品中大黄素、大黄酚的含量，结果见表3。

3 讨论

清热凉血软膏为中药复方制剂，制样过程中其基质蜂蜡较难去除，本试验借鉴冰水浴冷却过滤的方法来排除干扰，取得良好效果。本文参照《中国药典》外用膏剂相关质量标准，采用高效液相色谱系统，以Dionex Ultimate 3000-C18为固定相，甲醇-0.1%磷酸（80∶20）为流动相，初步建立了清凉膏中主要指标成分大黄素、大黄酚的含量色谱测定方法。该方法与紫外分光法等其他方法相比较，检验先进，结果准确，重现性好，可优先用于清凉膏的质量控制。

参考文献

[1]郑艳春，杨冬丽，崔雅慧，等.HPLC测定新健胃包芯片中大黄素大黄酚含量[J].中国现代药物应用，2012，6（22）：127-129.

[2]尹华，盛云杰.HPLC测定六味安消胶囊中大黄素、大黄酚的含量[J].中医药学刊，2006，24（10）：1940-1942.

[3]国家药典委.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[4]陈志琦. HPLC测定益心康泰胶囊中大黄素大黄酚含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（10）：88-89.

（收稿日期：2014.06.08）endprint

2.2.3 缺大黄阴性对照溶液的制备 取未加入大黄粉前的清凉膏中间体，按供试品溶液的制备方法制成缺大黄阴性对照品溶液。

2.3 前处理工艺的考察 分别考察加热回流和超声震荡两种提取方法，两者所测结果接近，加热回流法操作简便耗时长，超声提取耗时短对仪器操作要求较高;考察提取时间因素的影响，20min、30min、1h、2h提取后测定结果，其中30min处理后测定结果开始稳定;对同批样品以常温，加热，冰水浴冷却[1、2]进行提取处理，发现以冰水浴处理后含量测定明显高于其他方法，且结果重复性较好;本文参考《中国药典》2010版（一部）大黄药材测定的流动相体系[3]，在流动相中添加少量酸可以使色谱峰基线分离并峰形对称，考察了盐酸和硫酸并通过调整流动相的配比，使大黄素、大黄酚的分离度、拖尾因子等符合系统适应性试验的要求，最终确定最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（80∶20），以2.5mol/l硫酸溶液为酸性添加剂[4]。

2.4 空白试验 取大黄素、大黄酚对照品溶液、清凉膏供试品溶液及缺大黄的阴性对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样10μl（图1）。结果表明：对照品溶液和清凉膏供试品溶液色谱图在保留时间10、15min出现大黄素、大黄酚的色谱峰;缺大黄阴性对照品溶液色谱图在相同保留时间无色谱峰，说明其他成分对测定无干扰。

2.5 线性关系考察 精密称取大黄素、大黄酚混合对照溶液（每1ml含大黄素10μg，大黄酚20μg），吸取1，3，10，15，20μl注入高效液相色谱仪，在254nm测定大黄素、大黄酚的峰面积。以对照品量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：大黄素Y=59.069X+0.0301（r=0.9999），大黄素Y=88.598X+0.1158（r=0.9999），结果表明大黄素在0.010～0.200μg/ml、大黄酚在0.020～0.400μg/ml呈良好线性关系。

2.6 精密度试验 精密称取混合对照品溶液10μl，按上述色谱条件连续重复进样6次测量峰值，结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.21%和0.10%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一批号供试品溶液（130110），按上述供试溶液测定方法，分别于0，1，2，4，12小时进样10μl测定，结果大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为2.25%、0.13%，表明样品溶液在12h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批号清凉膏（130110）5份，按上述供试溶液制备和测定方法，进样 10μl测定，结果显示大黄素的平均含量为0.0282mg/g，RSD为1.91%;大黄酚的平均含量为0.0788mg/g，RSD为2.16%，表明重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的清凉膏样品1.0g（批号130110），分别加入每1ml含大黄素10μg、大黄酚20μg的对照品溶液15ml，按上述供试溶液制备和测定方法平行测试5份，计算加样回收率，结果见表1、2。大黄素的加样回收率在98.26%～102.33%之间，平均回收率为100.33%，RSD为1.743%;大黄酚的加样回收率在98.33～102.96%之间，平均回收率为100.252%，RSD为1.942%。

2.10 样品的含量测定 取不同的5个批号干燥至恒重的清凉膏2g，按“1.3.2”的方法在上述色谱条件下进行测定，每个样品平行测定3次，计算样品中大黄素、大黄酚的含量，结果见表3。

3 讨论

清热凉血软膏为中药复方制剂，制样过程中其基质蜂蜡较难去除，本试验借鉴冰水浴冷却过滤的方法来排除干扰，取得良好效果。本文参照《中国药典》外用膏剂相关质量标准，采用高效液相色谱系统，以Dionex Ultimate 3000-C18为固定相，甲醇-0.1%磷酸（80∶20）为流动相，初步建立了清凉膏中主要指标成分大黄素、大黄酚的含量色谱测定方法。该方法与紫外分光法等其他方法相比较，检验先进，结果准确，重现性好，可优先用于清凉膏的质量控制。

参考文献

[1]郑艳春，杨冬丽，崔雅慧，等.HPLC测定新健胃包芯片中大黄素大黄酚含量[J].中国现代药物应用，2012，6（22）：127-129.

[2]尹华，盛云杰.HPLC测定六味安消胶囊中大黄素、大黄酚的含量[J].中医药学刊，2006，24（10）：1940-1942.

[3]国家药典委.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[4]陈志琦. HPLC测定益心康泰胶囊中大黄素大黄酚含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（10）：88-89.

（收稿日期：2014.06.08）endprint