狗枣猕猴桃钙调节蛋白基因生物信息学分析

李然红，董世鹏，陈 鑫，安文和

［1.植物生物学黑龙江省高校重点实验室（哈尔滨师范大学），黑龙江 哈尔滨 150025；2.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157012］

狗枣猕猴桃钙调节蛋白基因生物信息学分析

李然红1，2，董世鹏2，陈 鑫2，安文和2

［1.植物生物学黑龙江省高校重点实验室（哈尔滨师范大学），黑龙江 哈尔滨 150025；2.牡丹江师范学院生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157012］

通过NCBI查找到狗枣猕猴桃钙调节蛋白基因序列，利用生物信息学方法对该基因编码蛋白的理化性质、二维结构、三维结构、糖基化位点、所属蛋白家族、代谢途径、进化地位等信息进行了预测。结果表明，该蛋白富含天冬氨酸和谷氨酸，不含N-糖基化位点和O-糖基化位点，属于EF-hand蛋白家族，在钙信号、cAMP信号转导及植物与病原菌的相互作用、细胞减数分裂等过程中均有重要作用。

狗枣猕猴桃；钙调节蛋白；生物信息学；蛋白家族；代谢途径

狗枣猕猴桃（Actinidia kolomikta），别名狗枣子，属猕猴桃科猕猴桃属藤本植物，是最为耐寒的猕猴桃种类之一［1］，其果实酸甜可口、柔软多汁，富含多种氨基酸、维生素和矿物质［2～3］，具有强壮、解热及收敛、调节人体血液中pH、使血液保持鲜红，增加其输送氧气、营养物质等多种医疗保健功能［4～5］，以及降血脂、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等医药功能［6～8］。狗枣猕猴桃雄株叶片上半部分常变成白色或者粉色，直至紫红色，也是非常好的观叶树种。钙调节蛋白是一种能与钙离子结合从而调节细胞代谢途径的蛋白质，在真核生物细胞中起到至关重要的作用［9］。该研究通过生物信息学的方法，对狗枣猕猴桃钙调蛋白基因及蛋白进行了理化性质、三维结构、糖基化位点、所属蛋白家族、代谢途径等信息进行了预测，以期为其生物学特性的研究及应用奠定理论基础。

1 材料与方法

通过NCBI在线搜索，查找到狗枣猕猴桃钙调节蛋白基因及其编码序列（GenBank：EF441489.1），用BlastP进行同源性搜索，理化性质用ProtParam进行分析，三维结构用Geno3D进行预测，用Net-NGlyc对N-糖基化位点进行预测，NetOGlyc对O-糖基化位点进行预测，Pfam进行蛋白家族预测，KEGG进行代谢途径预测。

2 结果与分析

2.1 理化性质预测

通过ProtParam对狗枣猕猴桃钙调蛋白理化性质进行预测，结果表明，该蛋白由148个氨基酸构成，分子量16699.4 D，等电点为4.10，富含天冬氨酸和谷氨酸。该蛋白共有4个钙离子结合位点，1个钙离子需要4个氨基酸来结合，如封三图1所示。

2.2 多序列比对

通过BlastP对狗枣猕猴桃钙调节蛋白进行同源性搜索，结果表明，该蛋白与葛枣猕猴桃、美丽猕猴桃、拟南芥、胡萝卜、玉米、甜橙等多种植物的蛋白序列有相似性。选取其中部分序列进行比对发现，钙调节蛋白在不同生物细胞内结构保守性很强，有人推测若该蛋白结构发生突变很可能被致死，因而在整个进化过程中都始终保持结构的保守性［10］。

选取的序列如下：狗枣猕猴桃钙调节蛋白（ABR21730.1），海枣钙调节蛋白（XP_008810798.1），谷子钙调节蛋白（XP_004961666.1），拟南芥z-box结合因子（CAM12360.1），葛枣猕猴桃钙调节蛋白（ABR21756.1，ABR21757.1），美丽猕猴桃钙调节蛋白（ABR21718.1），绿豆钙调节蛋白（ABG82015.1），甜菊钙调节蛋白（AAL79908.1），野生大豆钙调节蛋白（KHN34595.1），甘薯钙调节蛋白（ACG63497.1），玉米钙调节蛋白（NP_001105490.1，NP_001167662.1），菠菜钙调节蛋白（P04353.2），胡萝卜钙调节蛋白（AAQ63461.1，AAT73619.1），北美云杉钙调节蛋白（ABK22713.1）， 甜 橙 钙 调 节 蛋 白（XP_006470430.1）。其中，狗枣猕猴桃钙调节蛋白与海枣钙调节蛋白（XP_008810798.1）的同源性最高（封三图2）。

将选取的序列进行进化树分析，结果表明，狗枣猕猴桃钙调节蛋白（ABR21730.1）与海枣钙调节蛋白（XP_008810798.1）的亲缘关系最近，而与甜橙钙调节蛋白（XP_006470430.1）的亲缘关系最远（图3）。

2.3 二级结构预测

用ExPASy的SOPMA软件在线对狗枣猕猴桃钙调节蛋白的二级结构进行预测，结果如封三图4所示。组成狗枣猕猴桃钙调节蛋白的148个氨基酸中，其中90个氨基酸可能会形成α螺旋，38个可能形成无规则卷曲，13个可能形成β-转角，7个可能形成延伸连。

2.4 三维结构预测

用Geno3D对狗枣猕猴桃钙调节蛋白进行预测，结果如封三图5所示。该蛋白含有2个EF-hand结构域，每个结构域由2个α螺旋及其中间的一个短的非螺旋结构连接，为钙离子的结合位点。

2.5 糖基化位点预测

通过NetNGlyc1.0 server对狗枣猕猴桃钙调节蛋白N-糖基化位点进行预测，结果表明，该蛋白内有2个潜在的N-糖基化位点，但是由于该蛋白在细胞质内发挥作用，不含有信号肽序列，因此很有可能不含N-糖基化位点。采用NetOGlyc4.0 server对O-糖基化位点进行预测，预测分数均小于0.5，故推测该蛋白内不含O-糖基化位点。

图3 狗枣猕猴桃钙调节蛋白相似性序列进化树

图7 狗枣猕猴桃钙调节蛋白参与钙信号转导途径

2.6 所属蛋白家族预测

通过Pfam对狗枣猕猴桃钙调节蛋白所属蛋白家族进行预测，结果表明，该蛋白含有EF-hand结构域，属于EF-hand 7蛋白亚家族。EF-hand具有helix-loop-helix结构域，是钙结合蛋白这个大家族中的一员，EF-hand结构域包含一个helix-loop-helix的拓扑结构，就像人手的大拇指和食指，在这个结构当中，Ca2+由配体协调连接在环中。EF-hand包含2个α螺旋，2个α螺旋由一个较短的环连接，这个环通常由12个氨基酸组成，通常是连接钙离子的位点（封三图6）。

2.7 代谢途径分析

用KEGG对狗枣猕猴桃钙调节蛋白代谢途径进行分析，结果表明，该蛋白参与Rap1、钙信号、cGMP-PKG、cAMP、磷脂酰肌醇等信号途径（图7）。最重要的是其通过直接或间接调节胞内各种代谢调节剂如激素、第二信使（钙离子和cAMP）代谢，进而对至少15种重要代谢相关的酶起调节作用，间接参与细胞的代谢活动。

3 结论

狗枣猕猴桃钙调节蛋白属于EF-hand 7蛋白家族，由148个氨基酸构成，分子量16 699.4 D，富含天冬氨酸和谷氨酸，这2种氨基酸属于酸性氨基酸，因而使该蛋白等电点呈偏酸性，为4.10。其序列具有高度保守性，多序列比对结果表明其与海枣钙调节蛋白同源性最高。狗枣猕猴桃钙调节蛋白不含N-糖基化位点和O-糖基化位点，这可能与其不是分泌型蛋白有关；狗枣猕猴桃钙调节蛋白是钙离子信号应答的关键蛋白，并且参与Rap1、钙信号、cGMP-PKG、cAMP、磷脂酰肌醇等信号途径。

［1］ 赵瑞艳，付钓钧，张海军.狗枣猕猴桃的开发利用［J］.中国林业，2007（24）：42.

［2］ 苏玉彤，张增江，刘长武.狗枣猕猴桃利用价值及开发前景［J］.特种经济动植物，2014（6）：46-47.

［3］ 陈显锋，王玉红，卜庆军.浅谈狗枣猕猴桃的开发利用［J］.中国林副特产，2013（3）：105-106.

［4］ 李平亚，卢爱平，马冰如，等.狗枣猕猴桃根化学成分的研究［J］.中国中药杂志，1992，17（7）：420-421；446.

［5］ 贾明月，陈嘉峰，杨东娜，等.狗枣猕猴桃叶提取物黄酮对大鼠急性脑缺血后caspase-3、VEGF表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2010（6）：514-517.

［6］ 黄 瑾，郑玉建，王维山，等.狗枣猕猴桃根对小鼠抗氧化作用［J］.中国公共卫生，2008（1）：75-76.

［7］ 左丽丽.狗枣猕猴桃多酚的抗氧化与抗肿瘤效应研究［D］.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2013：9.

［8］ GUAN D，ZHANG Z，YANG Y，et al.Antioxidant and antitumor activities of water extracts from the root of Actinidia kolomikta［J］.Exp.Ther.Med.，2011，2（1）：33-39.

［9］ SONG Z，CHEN Q，DING Q，et al.Function of Ca（2+）-/calmodulin-dependent protein kinase IV in Ca （2+）-stimulated neuronal signaling and behavior［J］. Sci.China Life Sci.，2015，58（1）：6-13.

［10］ 梁秋芬，刘宽灿，徐碧玉，等.钙调蛋白在植物发育中的功能［J］.生命科学研究，2005（S2）：1-5.

（本文责编：金 苹）

Bioinformatics Analysis of Calmodulin gene in Actinidia kolomikta

LI Ran-hong1，2，DONG Shi-peng2，CHEN Xin2，AN Wen-he2
（1.Key Laboratory of Plant Biology，College of Heilongjiang Province，Harbin Normal University，Harbin Heilongjiang 150025，China；2.College of Life Sciences and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang Heilongjiang 157012，China）

The Calmodulin gene of Actinidia kolomikta was found through Genebank of NCBI.And the physical and chemical properties，two-dimensional structure，three-dimensional structure，glycosylation sites，protein family，metabolic pathways and other informations of the Calmodulin in Actinidia kolomikta were predicted by bioinformatics methods.The results showed that the protein is rich in glutamic acid and aspartic acid，does not contain N-glycosylation sites and O-glycosylation sites，belongs to the EF-hand protein family，which plays an important role in the calcium signal and cAMP signal transduction，meiosis and pathogen interaction.

Actinidia kolomikta；Calmodulin；Bioinformatics；Protein family；Metabolic pathways

S663.4；Q51

A

1001-1463（2015）02-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.02.001

2015-01-15

哈尔滨师范大学“植物生物学重点实验室”开放项目（ZK201208）；植物生物学黑龙江省高校重点实验室（哈尔滨师范大学）开放基金

李然红（1981—），女，黑龙江牡丹江人，硕士，讲师，主要从事遗传学、基因工程研究。联系电话：（0）13904830428。E-mail：swxlrh@126.com