PARP-1体外活性测定方法的建立及其应用

陈 蕴， 杨雪丽， 周海燕， 黄 超， 王文龙， 龚笑海， 冯柏年， 金 坚

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

PARP-1体外活性测定方法的建立及其应用

陈 蕴， 杨雪丽， 周海燕， 黄 超， 王文龙， 龚笑海， 冯柏年， 金 坚*

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

建立PARP-1的体外活性测定方法并对84个具有潜在PARP抑制活性的化合物进行筛选。从Sf9昆虫细胞中提取酶液，以NAD+为底物，DNA为激活剂，建立PARP-1的活性测定方法；以高通量技术参数评价此方法，用已知PARP抑制剂进行验证，并以此方法进行PARP抑制剂的筛选。结果显示，确定的酶促反应体系为：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1。评价Z'因子为0.76，S/B值为3.58。基于此模型筛出47个化合物在浓度7.4 μmol/L时对PARP-1的抑制率达到60%以上。表明所建立的PARP-1活性测定方法，适用于PARP-1抑制剂的高通量筛选。

多聚二磷酸腺苷核糖基聚合酶-1；活性测定；抑制剂；高通量筛选

PARP（Poly（ADP-ribose）polymerase，聚ADP核糖基聚合酶）是一种参与翻译后修饰的核蛋白质，能催化β-NAD+脱去烟酰胺生成PAR（poly（ADP-ribose）），与多种接受体蛋白质形成酯键连接，进而影响多种细胞过程。至今已发现18种PARPs，其功能各异也有交叉，参与DNA修复、转录控制、基因稳定和细胞死亡和转化等过程[1-2]。

PARP-1参与细胞内90%以上的聚ADP-ribose作用，在糖尿病并发症、动脉粥样硬化、感染性休克、关节炎等疾病过程中发挥重要作用[3-4]。此外，PARP-1因与其产物PAR参与DNA碱基切除修复过程，PARP抑制剂在肿瘤治疗中成为联合用药及放射增敏的有效选择[5]。虽然Pfizer开发的PARP抑制剂AG014699在2003年首先联合Temozolomide用药进入癌症治疗的临床研究[6]，但至今仍未有正式上市的PARP抑制剂，这些都为PARP抑制剂的相关研究和研制，提供了有效的参考价值[7]和可能的广阔市场前景。

中国药科大学[8]和北京协和医学院药物研究所曾在多种中药及天然药物中筛选PARP-1抑制剂，但PARP-1的制备和体外筛选方法的建立仍制约着新型PARP抑制剂在我国的研究和发展。作者所在实验室前期已成功利用杆状病毒/昆虫细胞进行hPARP-1的高表达[9]，解决了PARP-1的制备问题。如何利用获得的PARP-1建立灵活稳定的PARP抑制剂高通量筛选方法，即是本课题研究中拟解决的关键问题。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

表达PARP-1的Sf9昆虫细胞由作者所在实验室保存，筛选样品由江南大学药学院冯柏年教授提供。Deoxyribonucleic acid from calf thymus Type XV，Activated，购于Sigma公司；NAD+氧化型辅酶Ⅰ，Roche公司产品；96孔白板，Corning Costar公司产品；AZD2281（Ku-0059436，Olaparib），购于 Selleck公司；其他化学试剂均为国药集团分析纯。

所用荧光化学发光微孔板读数仪型号为Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL。

1.2 方法

1.2.1 PARP-1制备1 000 g离心5 min收集细胞，弃上清液，用裂解液（25 mmol/L Tris-HCl，

10 mmol/L EDTA，50 mmol/L葡萄糖，1 mol/L NaCl，质量分数 0.02%Tween-20，0.5 mmol/L PMSF，pH 8.0）重悬细胞。冰浴超声破碎，15 000 g、4℃离心40 min，收集上清液，低温透析将裂解液置换为存储液 （25 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L BSA，质量分数1%TritonX-100，体积分数50%甘油，pH 8.0），活性测定后分装保存于-80℃冰箱。

1.2.2 NAD+的转化反应原理NAD+在碱性条件下与苯乙酮反应后，与过量的甲酸经加热反应转化为高荧光活性物质，通过测定生成物的荧光值来检测反应物NAD+的量[10]。利用反应缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgCl2，pH 8.0）将NAD+稀释成不同浓度，以每孔30 μL加入96孔板，每个浓度4个复孔，于室温条件下轻微振荡15 min；加入10 μL 2 mmol/L KOH和10 μL体积比1/5的苯乙酮-乙醇，4℃/25℃反应5～15 min；加入50 μL体积分数88%甲酸 （终体积分数为44%），110℃反应5 min；室温平衡10～40 min，荧光化学发光分析仪检测，激发波长355 nm，发射波长460 nm。RFU：Relative Fluorescence Units，相对荧光单位。

1.2.3 PARP-1活性测定原理PARP-1被DNA激活后以NAD+为底物进行催化反应，通过测定剩余NAD+的量，可检测出PARP-1消耗的NAD+的量，从而反映出PARP-1的相对活性。将PARP-1与DNA以不同浓度混合至 20 μL，加入40 μL NAD+（终浓度为12.5 nmol/L），每个浓度4个复孔，只含有DNA的为空白对照，不含PARP-1的为阴性对照，含PARP-1的为试验组，室温轻微振荡15 min；加入20 μL 2 mmol/L KOH和20 μL体积比1/5的苯乙酮-乙醇，4℃反应10 min；加入100 μL体积分数88%甲酸，110℃反应5 min；室温平衡30 min，荧光化学发光分析仪检测。相对酶活力

酶活性单位：12.5 nmol/L NAD+与酶在 15 μg/mL DNA激活作用下于室温反应15 min，1 min内转化1 μmol/L NAD+所需的酶用量定义为1 U。

1.2.4 PARP-1抑制剂高通量筛选方法评价Z'因子是用来评估高通量筛选模型的一种重要技术参数，当Z'＞0.5时才认为该模型是可行的，Z'因子越接近1.0，表明该模型的可靠性和可行性越高[11]。可

式（2）中：SD为标准差；M为平均值；“sig”体系：不加PARP-1，只含12.5 nmol/L NAD+和15 μg/mL DNA；“back”体系：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1。按照上述反应条件取多个孔的数据进行计算分析。信号本底比（S/B）反映的是筛选模型获得的数据与本底数据之间的距离。一般情况下，信号本底比的数值应大于3[12]，其计算公式为

1.2.5 化合物的PARP-1抑制活性测定所有测定样品由DMSO溶解并配制成10 mmol/L。化合物适当稀释后以每孔4 μL加入96孔板，PARP-1和DNA混合后以反应缓冲液补足至 16 μL，加入40 μL NAD+（终浓度：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1），3个复孔，室温轻微振荡15 min；后续步骤同1.2.3。只含NAD+和DNA的为阴性对照组，只含NAD+、DNA和PARP-1的为阳性对照组，含化合物的为试验组。抑制率根据公式（2）计算：

以GraphPad Prism5.0计算IC50。

1.2.6 数据分析所有实验数据均以±s表示，以GraphPad Prism 5.0进行统计分析，其中*表示p＜0.05；**表示p＜0.01；***表示p＜0.001。

2 结果与讨论

2.1 NAD+反应条件的确定

NAD+与苯乙酮在4℃作用10 min，时间较短，温度难以控制，为了解该步骤对最终结果的影响，对该反应条件的温度和时间分别进行探索。图1（a）是NAD+浓度在0～100 nmol/L时，与苯乙酮在4℃或25℃条件下反应10 min的结果，测得RFU值并无差异，表明此反应中温度对结果并无影响，为减少苯乙酮的挥发，后续实验选择4℃作为反应温度。图1（b）是0～100 nmol/L NAD+与苯乙酮在4℃条件下作用不同时间的结果，NAD+浓度较高时，反应5 min与反应10 min的RFU值显示出一定的差异，而10 min与15 min时的无差异，由此表明该浓度范围内的NAD+与苯乙酮在10 min内即可反应完全，后续实验确定10 min为反应时间。NAD+与苯乙酮反应后，需要加入终体积分数44%的甲酸，于110℃反应5 min，然后室温平衡后测定。为得到稳定的结果，实验探索了平衡时间对RFU值的影响，结果如图1（c）所示，NAD+浓度为12.5 nmol/L时，反应平衡30 min后RFU逐渐趋于稳定，后续实验以30 min作为平衡时间。

图1 NAD+的化学定量反应条件Fig.1 Reaction conditions of NAD+conversion

2.2 底物NAD+浓度的确定

为减少后续实验误差，将酶反应体系扩大至60 μL，测定NAD+浓度的标准曲线以选择底物用量。结果见图2，NAD+浓度在0.1～100 nmol/L时与RFU值呈良好的线性关系，实验中测得不含NAD+的空白组RFU值为5.0±0.2，选取RFU值500±20为后续实验的阴性值，此时信噪比为100，可有效减少背景值对实验结果的影响，相对应的NAD+浓度即12.5 nmol/L作为底物工作浓度。

图2 底物NAD+与RFU值的线性关系Fig.2 NAD+concentration is in a linear relationship with fluorescence intensity

2.3 激活剂DNA浓度的确定

以12.5 nmol/L NAD+作为底物，通过优化DNA浓度以提高PARP-1对NAD+的催化作用，结果见图3，选取3个不同的PARP-1用量，随着DNA浓度的增加，PARP-1的活性不断增加，但在10 μg/ mL达到最高值，继续增加DNA浓度PARP-1活性并无提高，为确保反应中PARP-1的最高活性，选取15 μg/mL作为DNA的工作质量浓度。

图3 DNA质量浓度对PARP-1活性的影响Fig.3 Effects of DNA concentration on PARP-1 activity

图4 PARP-1的稳定性Fig.4 Activity changes of PARP-1

2.5 PARP-1酶的用量的确定

从1 L昆虫细胞（2×106mL-1）中共获得30 mL PARP-1粗酶液。15 μg/mL DNA激活作用下，不同浓度PARP-1对12.5 nmol/L NAD+的作用结果如图5所示，随着酶用量增加，反应剩余底物不断减少。设置S/B值为4，将反应15 min后NAD+（12.5 nmol/ L）消耗至（25±2）%（（3.125±0.25）nmol/L）时的酶活力单位数（6.25×10-4U）作为PARP-1的用量，结果表明该批次粗酶液约0.6 μL即可达到该筛选体系所需要的PARP-1用量。

2.4 PARP-1酶的稳定性验证及DMSO体积分数对PARP-1活性的影响

将PARP-1在室温条件下放置0～60 min后分别进行测定，结果发现PARP-1活性基本无变化，如图4（a）所示。后续化合物筛选过程中以DMSO作母液，为排除DMSO对结果的影响，测定了不同DMSO体积分数对PARP-1活性的影响，结果如图4（b）所示，反应体系DMSO体积分数高于2.7% 时对PARP-1的活性有显著抑制作用。

图5 PARP-1活性测定Fig.5 PARP-1 activity assays

2.6高通量技术参数评价

为了验证该方法的稳定性和可靠性，以高通量技术参数进行评价，得到“sig”值为478±8，“back”值为133±20，计算Z'为0.76，S/B=3.58。因此可认为该反应体系适用于PARP-1抑制剂的高通量筛选。

2.7 已知PARP抑制剂的验证实验

选取3个已知PARP-1抑制剂对上述筛选方法进行验证，结果见图6，测得PHE、DPQ、AZD2281的IC50分别为562.4、369.6、6.8 nmol/L，因此可认为本模型是一种高效灵敏的PARP抑制剂的活性测定方法。

2.8 化合物筛选

对84个具有潜在PARP抑制活性的化合物进行初步筛选，结果如图7所示，相同浓度的不同化合物表现出对PARP-1活性的不同抑制作用，其中抑制率高于0.6的有47个。

图6 PARP抑制剂的IC50测定Fig.6 Concentration-inhibition curve of PARP inhibitors on PARP-1

图7 化合物的PARP-1抑制活性筛选Fig.7 Screening for PARP-1 inhibitors in 96 well plates

3 结语

PARP抑制剂的筛选模型以PARP酶的活性为基础，而PARP活性测定的标准方法常需要放射性/生物素标记的NAD+或PAR抗体，成本高，操作较繁琐[13-16]。

本课题研究中借鉴Karson S.Putt的NAD+化学定量法，首先进行NAD+反应条件的评估，有效地控制了操作过程中的稳定性和结果的重复性。此外，研究所用的PARP-1来自作者所在实验室已成功表达的昆虫细胞，经一步超声破碎即可获取，经济且高效。同时，为克服酶的活性差异带来的影响，作者首先优化底物NAD+的浓度，选择合适的PARP-1活力单位数，通过调节酶液的用量以达到所需的酶活力单位数，同时优化酶激活剂DNA的浓度，从而建立了灵活便捷的PARP-1抑制剂筛选方法。最后，以高通量技术参数评价该方法，并以已知的PARP抑制剂对该活性评价体系进行验证，建立了有效的高通量筛选模型，并以此模型对84个具有潜在PARP抑制活性的化合物进行了评价。

同时，该活性测定方法也适用于PARP家族其他蛋白质活性的检测，但由于NAD+转化条件的限制，反应载体需选用耐高温材料；含有烷基吡啶类结构的化合物会产生较高的本底值。而在研究前期为降低酶的用量，反应体系中底物浓度设置较低，在操作过程中易影响结果的重复性，后期可适当提高NAD+浓度，按照本研究方法以酶的活性为基础，建立新的反应体系和高通量筛选模型。

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Establishment and Application of Enzymatic Assay for Poly(ADP-Ribose)Polymerase-1

CHEN Yun， YANG Xueli， ZHOU Haiyan， HUANG Chao，WANG Wenlong， GONG Xiaohai， FENG Bainian， JIN Jian*
（School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To establish an enzymatic assay for poly（ADP-ribose）polymerase-1 and screen PARP inhibitors from 84 potential compounds.Crude PARP-1 was extracted from Sf9 insect cells.With nicked DNA as activator，PARP-1 was used to catalyze the hydrolysis of the substrate NAD+，the RFU value measured from the remaining NAD+was used to evaluate the activity of PARP-1 or efficiency of PARP inhibitors.A 96-microwell screening method was set up by optimizing the reaction system．The screening method was assessed with high throughput index，such as Z'factor，signal to back ground （S/B）and validated by well-known PARP inhibitors such as PHE，DPQ and AZD2281.84 compounds were assayed for PARP inhibition through the established method.The enzymatic reaction system was optimized as：12.5 nmol/L NAD+，15 μg/mL DNA，6.25×10-4U PARP-1.The Z'factor is 0.76，S/B is 3.58 and the IC50of PHE，DPQ and AZD2281 is 562.4 nmol/ L，369.6 nmol/L and 6.8 nmol/L.There are 47 compounds showed 60%or more PARP-1 inhibition efficiency at the concentration of 7.4 μmol/L.An enzymatic assay of PARP-1 was successfully established.Itcanbeeffectivelyappliedtohigh-throughputscreeningforPARPinhibitors．

poly（ADP-ribose）polymerase-1，enzymatic assay，inhibitors，high-throughput screening

Q 556.2；R 965.1

A

1673—1689（2015）03—0324—06

2014-04-14

陈 蕴（1972—），女，上海崇明人，工学硕士，讲师，主要从事药理学研究。Email：chenyun72@126.com

*通信作者：金 坚（1960—），男，浙江东阳人，教授，博士研究生导师，主要从事药物设计与分子药理学研究。E-mail：jinjian31@126.com