橘核质量标准的优化研究

黄天山，王晓清，罗嘉琪，王淑美，孟江，于江泳，梁生旺

橘核质量标准的优化研究

黄天山1，王晓清2，罗嘉琪1，王淑美1，孟江1，于江泳3，梁生旺1

(1.广东药学院中药学院/国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室/广东高校中药质量工程技术研究中心，广东广州510006；2.郑州澍青医学高等专科学校药学系，河南郑州450000；3.国家药典委员会，北京100050)

目的完善橘核药材的质量标准。方法采用2010年版《中国药典》中方法对橘核药材中的水分、灰分及浸出物进行测定，并对薄层鉴别的条件及指标成分的高效液相色谱测定条件进行了优化。结果测定橘核药材中水分不得超过7.0%，总灰分不得超过5.0%，95%乙醇热浸出物不得少于34.0%，橘核柠檬苦素质量分数不得低于0.49%、诺米林质量分数不得低于0.46%；薄层鉴别斑点清晰，易于识别。结论橘核药材的水分、灰分、浸出物、薄层鉴别、指标成分质量分数研究可为橘核药材质量标准的修订、提高提供方法与依据。

橘核；质量标准；薄层鉴别；高相液相色谱法

橘核为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟种子[1]356，始载于五代时期著名的本草书《日华子本草》[2]，能“治腰痛，膀胱气，肾疼”。现代研究表明，橘核具有的镇痛消炎、抗肿瘤作用，以及对睾丸肿痛、乳痈肿痛的治疗与古籍记载基本吻合[3-6]。

近年来，有关橘核及其炮制品化学成分、药理作用的研究报道很多[7-12]，但关于其质量标准的研究却很少，2010年版《中国药典》也仅对橘核的来源、性状、显微及其炮制方法进行了相关规定，不能满足全面控制橘核药材质量的要求。为进一步提高橘核的质量控制水平，规范其质量，本试验在现行版药典质量标准的基础上，对12批不同产地橘核从薄层鉴别、水分、灰分、浸出物、质量分数测定等5方面进行了研究，并建立了相应的标准。

1 仪器与试药

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Luna 5 μm C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-500E超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Sartorius AG十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；双槽薄层层析缸(10 cm×10 cm，10 cm× 20 cm)；2F-20D暗箱式紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；定量毛细管(美国Drummond公司)；玻璃薄层板(5 cm×10 cm，10 cm×20 cm)；GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SX2-4-10型高温箱形电炉(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；坩埚钳，坩埚。

流动相用乙腈、甲醇均为欧普森色谱纯，水为超纯水；其他试剂石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、H3PO4均为分析纯。

柠檬苦素对照品(中国食品药品检定研究院，批号:800-200102)；诺米林对照品(中国食品药品检定研究院，批号:130118002)；食盐(中盐长江盐化有限公司，批号:20130806XG)。橘核药材分别购于广州市清平药材市场、广东普宁药材市场、广州致信药业有限公司等，经广东药学院中药学院李书渊教授鉴定为芸香科植物Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟种子。具体来源见表1。

表1 12批橘核药材的来源Table 1 Source of 12 batches of C.reticulata

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

分别取12批药材细粉，各1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入石油醚20 mL，超声处理30 min，滤过。滤渣挥干石油醚，加入二氯甲烷20 mL，超声 30 min，滤过。滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另称取对照品柠檬苦素、诺米林各适量，分别加甲醇配成质量浓度均为1 mg/mL的柠檬苦素对照品溶液、诺米林对照品溶液，即得。按照薄层色谱法[1]附录34-35试验，分别吸取上述3种溶液4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比4∶1)为展开剂，在室内环境条件下展开。取出，晾干，喷以二甲氨基卞亚基罗丹宁∶硫酸∶乙醇(体积比1∶2∶97)显色剂，在105℃加热5 min至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图1。

图1 12批橘核药材的薄层色谱图Figure 1 TLC chromatogram of C.reticulata

2.2 水分的测定

由于橘核不含挥发油成分，故其水分测定采用2010年版《中国药典》一部附录Ⅺ-H中的第一法，即烘干法[1]附录52-53。取供试品2 g，平铺于干燥至恒定质量的扁形称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在105℃烘箱干燥5 h。将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30 min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，冷却，称定质量，至连续2次称定质量的差异不超过5 mg为止。根据损失的质量，计算供试品中水分质量分数。

12批橘核水分质量分数分别为4.72%、5.94%、6.48%、5.85%、5.67%、5.70%、5.49%、6.08%、5.88%、5.65%、6.07%、5.79%，其平均值为5.78%，将橘核水分限量暂定为不得超过7.0%。

2.3 灰分测定[1]附录53

2.3.1 总灰分测定法 取供试品(过2号筛)4.0 g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定质量(准确至0.01 g)，缓缓炽热(注意避免燃烧)，至完全炭化时，逐渐升高温度至600℃，使完全灰化并至恒定质量。根据残渣质量，计算供试品中总灰分的质量分数。12批样品的测定结果分别是 3.97%、3.91%、3.93%、3.60%、3.78%、3.60%、3.62%、3.98%、4.01%、3.72%、3.94%、3.85%，其总灰分质量分数平均值为3.83%，将橘核总灰分限量暂定为不得超过5.0%。2.3.2 酸不溶性灰分测定法 取“2.3.1”项所得的灰分，在坩埚中小心加入稀HCl约10 mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用热水5 mL冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，洗涤液用AgNO3溶液检测，至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼至恒定质量。根据残渣质量，计算供试品中酸不溶性灰分的质量分数。12批样品的测定结果分别是0.018 6%、0.085 6%、0.047 0%、0.086 9%、0.022 8%、0.049 0%、0.045 7%、0.051 1%、0.071 4%、0.011 1%、0.031 6%、0.076 1%，平均值为0.049 7%。从以上数据可以看出，12批橘核中酸不溶性灰分极低，故暂定不测酸不溶性灰分。

2.4 浸出物的测定[1]附录62

采用热浸法测定。取供试品约4 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，精密加入95%(体积分数，下同)乙醇100 mL，塞紧，称定质量。静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，塞紧，再称定质量，用95%乙醇补足损失的质量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中。在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定质量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的质量分数。12批样品的测定结果分别是 46.39%、45.22%、39.66%、39.45%、41.88%、41.73%、42.94%、43.33%、43.88%、42.12%、40.89%、42.61%，其平均值为42.51%，将橘核醇溶性浸出物限量暂定为不得低于34.0%。

2.5 柠檬苦素、诺米林的质量分数测定[13]

2.5.1 色谱条件 色谱柱为Luna 5 μm C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(体积比62∶38)；柱温为35℃；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL。分别精密吸取混合对照品、供试品溶液10 μL，按上述条件进样测定，柠檬苦素、诺米林的保留时间分别为5.526、6.698 min，理论塔板数分别为5 854.130、7 186.004。结果见图2～图3。

图2 柠檬苦素、诺米林对照品溶液的HPLC图Figure 2 HPLC Chromatogram of limonin and nomilin reference substances

图3 橘核药材的HPLC图Figure 3 HPLC chromatogram of C.reticulata

2.5.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取柠檬苦素、诺米林对照品9.70、9.80 mg，分别置于10 mL量瓶中，用色谱级甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。再分别精密吸取上述2种对照品储备液2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用色谱级甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得柠檬苦素、诺米林质量浓度分别为0.194、0.196 mg/mL的混合对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备 取橘核粉末(过3号筛)约0.5 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加30 mL石油醚(60～90℃)于70℃水浴回流脱脂4 h，滤过。残渣挥干石油醚，加入二氯甲烷50 mL 于50℃水浴回流提取1 h，滤过，滤液置于蒸发皿中挥干，加色谱级甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.5.4 线性关系的考察 分别取“2.5.2”项下混合对照品溶液适量，分别精密吸取2、5、7、10、12、14、16、20 μL，分别按“2.5.1”项下条件测定，记录峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标分别作线性回归，得回归方程Y＝7.000 80×105X －6.028 6×103，r＝0.999 7和Y＝7.022 51×105X－3.292 9×103，r＝0.999 7。结果表明柠檬苦素在0.388～3.88 μg范围内，诺米林在0.392～3.92 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，分别按“2.5.1”项下色谱条件连续测定6次，记录柠檬苦素、诺米林的峰面积。计算得柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD值分别为0.56%、0.25%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 取橘核药材粉末(第4批)约0.5 g，精密称定，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，分别按“2.5.1”项下色谱条件测定并记录柠檬苦素、诺米林的峰面积。计算得柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD值分别为0.56%、1.97%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.7 重复性试验 取同一批(第4批)橘核药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.5.3”项下方法分别制备供试品溶液，分别按“2.5.1”项下色谱条件测定并记录柠檬苦素、诺米林的峰面积。计算得柠檬苦素、诺米林峰面积的RSD值分别为1.87%、2.94%。

2.5.8 加样回收率试验 分别精密称取柠檬苦素、诺米林对照品适量，加甲醇制成柠檬苦素、诺米林质量浓度分别0.453 3、0.483 3 mg/mL的对照品溶液。精密称取已知质量分数的橘核粉末0.25 g，共6份，精密称定。分别精密加入上述混合对照品溶液3 mL，分别按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件测定。结果测得柠檬苦素的平均回收率为99.91%，RSD为1.47%；诺米林的平均回收率为100.86%，RSD为1.25%。见表2。

2.5.9 样品的测定 分别取12批橘核药材，分别按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.5.1”项下色谱条件测定，每批样品平行操作2份，采用外标一点法进行质量分数测定，以干燥品计算，柠檬苦素和诺米林的质量分数结果见表3。

表2 橘核中柠檬苦素、诺米林的加样回收率试验结果Table 2 Recovery results of limonin and nomilin of C.reticulate (n＝6)

表3 12批橘核中柠檬苦素、诺米林的质量分数(以干燥品计)Table 3 Contents of limonin and nomilin of 12 batches of C.

由表3可知，橘核药材干燥品中柠檬苦素和诺米林质量分数平均值分别为0.622%和0.586%，故暂规定橘核中柠檬苦素质量分数限度标准为不得少于0.49%、诺米林质量分数限度标准为不得少于0.46%。

3 讨论

本研究考察了不同种类及比例的展开剂[环己烷-乙酸乙酯(体积比1∶1)、三氯甲烷-乙酸乙酯(体积比1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(体积比4∶1∶5)、二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比7∶4)、二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比4∶1)]、不同点样量、薄层板(自制硅胶H板、自制硅胶G板、硅胶G预制板)及不同温度湿度的分离效果，结果表明本方法重复性较好。

2010年版《中国药典》收录的水分测定方法有甲苯法、烘干法、减压干燥法及气相色谱法。由于橘核中不含挥发油，故本试验采用了烘干法。橘核是种子类药材，药材本身比较干净，但在采收和运输过程中可能引入泥土、砂石，故需要测定总灰分。浸出物测定中，分别以H2O、体积分数25%、50%、75%、95%乙醇为浸出溶剂，并以冷浸法、热浸法为浸出条件进行试验，比较试验结果，最后确定橘核浸出物测定所用方法为热浸法，浸出溶剂为95%乙醇。

橘核在1963年版《中国药典》首次被收载，此后历版药典均有收载，但关于其质量标准，直至2010年版《中国药典》也仅有来源、【性状】、【鉴别】(仅有横切面显微鉴别)描述，盐橘核仅有【炮制】的描述，并未收载橘核中有效成分的质量分数测定[1]356。本试验采用高效液相色谱法同时测定橘核药材中柠檬苦素和诺米林2个指标成分的质量分数，方法简便、准确，可作为橘核质量的评价方法之一。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010.

[2]吴越.日华子本草[M].合肥:安徽科学技术出版社，2005.

[3]温靖，施英，徐玉娟，等.柑桔果实中柠檬苦素抗炎镇痛作用的研究[J].食品科学，2007，28(11):515-518.

[4]程可佳，张忠，陈桂冰，等.橘核丸对少/弱精子症患者精液质量、生精细胞凋亡影响的临床研究[J].新中医，2008，40(11):39-41.

[5]蓝广和，王权胜，宾彬，等.橘核莪术丸颗粒治疗慢性附睾炎30例临床观察[J].河北中医，2013，35(8):1201-1203.

[6]华明珍.橘核丸化裁治疗乳腺增生120例[J].湖北中医杂志，2008，30(7):49-49.

[7]焦士蓉，李燕平，谢贞建，等.橘核成分及油脂脂肪酸组成的GC-MS分析[J].粮油食品科技，2007，15(5):32-34.

[8]汪金玉，陈康，徐小飞，等.高效液相色谱法测定橘核中橙皮苷的含量[J].广东药学院学报，2010，26(5):501-503.

[9]罗静，何中燕，裴瑾，等.橘核中柠檬苦素类物质纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(20):13-16.

[10]王巍静，许海丹，姜燕清.橘核中柠檬苦素的提取与含量测定[J].科学技术与工程，2013，13(2):439-441.

[11]何中燕，裴瑾，莫书蓉，等.不同橘核炮制品中柠檬苦素和诺米林的测定[J].中成药，2011，33(10):1761-1764. [12]莫书蓉，朱慧，缪舒益，等.中药橘核不同炮制品镇痛抗炎作用研究[J].中药药理与临床，2007，23(5):141-142.

[13]王晓清，别甜甜，孙飞，等.多指标正交试验法优选橘核的盐制工艺[J].中成药，2014，36(9):1933-1936.

(责任编辑:刘晓涵)

Optimization of Quality standard of Citrus reticulata Blanco Semen

HUANG Tianshan1，WANG Xiaoqing2，LUO Jiaqi1，WANG Shumei1，MENG Jiang1，YU Jiangyong3，LIANG Shengwang1

[1.School of Chinese Materia Medica/Key Laboratory of Digital Quality Evaluation Technique of Traditional Chinese Medicine(TCM)/State Administration of TCM/Guangdong Academies TCM Quality Engineering Technology Research Center，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou Shuqing Medical College，Zhengzhou 450000，China；3.Chinese Pharmacopoeia Commission，Beijing 100050，China]

ObjectiveTo optimize the quality standard and establish an HPLC fingerprint of Citrus reticulata Blanco Semen.MethodsThe moisture，ashes，and ethanol extracts of C.reticulata Blanco Semen were determined according to the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition，and the conditions of the TLC identification and HPLC were optimized.ResultsThe moisture in C.reticulata Blanco Semen was less than 7.0%，with the total ash within 5.0%.The 95%ethanol extract was not less than 34.0%by hot soak，and the contents of index components of limonin and nomilin were not less than 0.49%and 0.46%，respectively. The TLC identification spots were clear and easy to identify.ConclusionThe results might be used as important indicators for the quality standards of the C.reticulata Blanco Semen.

Citrus reticulata Blanco Semen；quality standard；TLC；HPLC

R284.1

:A

10.3969/j.issn.1006-8783.2015.05.011

1006-8783(2015)05-0607-05

2015-07-08

国家中医药管理局中医药行业科研专项(201207004-7)

黄天山(1988—)，2013级硕士研究生，Email:164973531＠qq.com；通信作者:梁生旺(1954—)，教授，从事中药质量控制研究，电话:020-39352172，Email:swliang371＠163.com。

时间:2015-09-30 15:33

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20150930.1533.006.html