脐带间充质干细胞移植对老年痴呆小鼠SAMP8学习记忆的影响

周会芳 张密霞 高 丽 庄朋伟 徐 倩 张艳军

(1 天津中医药大学中西医结合学院,天津,300193; 2 天津中医药大学中药学院,天津,300193)

脐带间充质干细胞移植对老年痴呆小鼠SAMP8学习记忆的影响

周会芳1张密霞2高 丽2庄朋伟2徐 倩1张艳军2

(1 天津中医药大学中西医结合学院,天津,300193; 2 天津中医药大学中药学院,天津,300193)

目的:探讨脐带间充质干细胞(HUMSCs)移植对老年痴呆小鼠SAMP8学习记忆能力的影响。方法:培养人脐带间充质干细胞,通过尾静脉以高中低3个剂量(2.5×105/0.2 mL/20 g、5×105/0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g)分别向7月龄SAMP8老年痴呆小鼠移植HUMSCs,并设立移植生理盐水组和R1小鼠正常对照组。HUMSCs移植45 d后,MORRIS水迷宫和跳台实验检测其学习记忆能力。结果:与R1正常对照小鼠比较,SAMP8老年痴呆小鼠生理盐水组学习记忆能力明显降低;和移植生理盐水组比较,细胞移植低剂量组水迷宫逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),穿越平台次数显著增加(P<0.05);跳台潜伏期显著延长(P<0.05),错误次数显著减少(P<0.05),结论:低剂量的脐带间充质干细胞移植能增强老年痴呆小鼠SAMP8的学习记忆能力。

脐带间充质干细胞;移植;SAMP8;学习记忆

老年痴呆症是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病,它使老年人记忆、思维、分析判断能力下降,严重影响老年人生活质量。治疗老年痴呆的药物和方法越来越多,实验研究表明多种药物或者运动等方法[1-3],都可以减缓老年痴呆症的发病进程,但效果仍不是很理想。因此,我们试图通过向老年痴呆成体移植有活力、分化能力强的细胞来阻止老年痴呆症的发病进程。

人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,HUMSCs)是具有多能性的一种干细胞,它具有高度自我更新和多向分化潜能的特点,越来越多的研究应用干细胞移植的方法来观察其对老年痴呆小鼠的治疗效果[4-5],成为干细胞领域的研究热点。因此,本实验拟向老年痴呆小鼠移植脐带间充质干细胞观察能否改善其学习记忆能力,为人类老年痴呆的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SAMP8老年痴呆小鼠,7月龄40只,对照组R1小鼠10只,由天津中医药大学第一附属医院提供,标准鼠饲料常规饲养。

1.1.2 细胞与试剂 人脐带间充质干细胞:协和干细胞基因工程有限公司提供。DMEM/F12、EGF、bFGF、谷氨酰、EDTA(Sigma公司);特优级胎牛血清(Bioind公司);青、链霉素(invitrogen公司);CO2恒温培养箱(Forma 3110，Thermo);倒置相差显微镜(DC300F,Leica),MORRIS水迷宫(DMS-2型,中国医学科学院药物研究所);YLS-3TB跳台记录仪(济南益延科技发展有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 脐带间充质干细胞培养 购买脐带间充质干细胞,以完全培养基培养进行培养(完全培养基为:DMEM/F12,含10%FBS、1%PS、1%LG、0.5%EGF、0.5%bFGF),每2～3 d换液,细胞长至80%融合后传代,培养至稳定生长的第3代。

1.2.2 实验分组和细胞移植 实验共分为5组,将40只SAMP8老年痴呆小鼠分为4组,每组10只,细胞移植高中低3个剂量组和移植生理盐水组,正常对照组(R1小鼠10只)。将第3代HUMSCs接种于75 cm2培养瓶,待细胞长至70%融合,胰蛋白酶-EDTA消化,调整细胞至所需浓度,通过尾静脉移植以2.5×105/0.2 mL/20 g、5×105/0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g 3个剂量分别对SAMP8进行移植,生理盐水组和正常对照组都尾静脉注射生理盐水。

1.2.3 MORRIS水迷宫检测 细胞移植后45 d,MORRIS水迷宫检测小鼠学习记忆能力[6],包括小鼠在水中的逃避潜伏期、平均游泳速度、第四象限路程、首次穿越时间和穿越次数,所有实验小鼠均提前熟悉环境1 d、隐蔽平台试验连续进行5 d、空间探索试验1 d,观察小鼠的学习记忆能力。隐蔽平台实验:实验开始前1 d让小鼠在不含平台的水池中自由游泳90 s,训练的时候将动物面朝池壁轻轻放入水中,记录小鼠从入水至爬上平台的时间(即逃避潜伏期),如果90 s内小鼠爬上平台,让小鼠在平台上停留15 s,如果90 s内找不到平台,将其潜伏期记为90 s,并抓起小鼠放在平台上休息15 s。正式的隐蔽平台实验连续进行5 d,每天上午下午各测试1次,记录每只小鼠的逃避潜伏期。空间探索试验:在5 d的隐蔽平台实验结24 h后,移走平台,然后将小鼠从相同的象限轻轻放入水中,记录小鼠在90 s内的平均游泳速度、在第四象限停留的时间和路程、第1次穿越平台位置时间以及穿越平台位置次数。

1.2.4 跳台实验 MORRIS水迷宫检测结束后2 d,开始小鼠跳台实验。正式实验前将小鼠放入跳台仪实验平台内,适应环境5 min,然后将实验小鼠轻放于跳台上,并接通铜栅通电(50 V),从跳台上跳下的小鼠四肢在接触铜栅的时候会受到电击,小鼠为了逃避电击,会跳下跳台返回安全区(若30 s内小鼠不跳下跳台,则将其放下跳台),反复学习5 min,并记录此训练的5 min内的触电次数(错误次数)。24 h后进行重复实验,测试小鼠的记忆能力,将实验小鼠轻放在跳台上,记录小鼠从放在跳台上至第1次跳下跳台的时间即潜伏期和5 min内的错误次数,作为记忆保持的评价指标。

2 结果

2.1 HUMSCs的形态 体外培养的HUMSCs呈长梭形贴壁生长,胞核清晰位于细胞中央,细胞呈漩涡状迅速生长。

2.2 脐带间充质干细胞移植对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响

2.2.1 水迷宫实验结果 从逃避潜伏期来看,空白对照组明显优于移植生理盐水组,均有统计学意义(P<0.05)。细胞移植各组数值分别处于生理盐水组和对照组之间,从第3天开始,移植低剂量组明显优于其他浓度的细胞移植组,与移植生理盐水组有统计学意义(P<0.05)且优于移植生理盐水组,结果见表1。

表1 HUMSCS移植对小鼠逃避潜伏期的影响

注:*与正常对照组比较,P<0.05,△与移植生理盐水组比较,P<0.05。

表2 HUMSCS移植对小鼠空间探索实验的影响

注:*与正常对照组比较,P<0.05,△与移植生理盐水组比较,P<0.05。

空间探索测试结果显示了小鼠对隐蔽平台的记忆水平,对照组和尾静脉生理盐水组在穿越次数有统计学意义;和生理盐水组比较,移植低剂量组组穿越原平台位置次数增加,并有统计学意义;各组平均游泳速度、第四象限路程、首次穿越时间差异无统计学意义,总体结果差异不大,结果见表2。

2.2.2 跳台实验结果 跳台实验中,各组小鼠一次性回避反应功能学习过程中错误次数没有差异,结果见表3。从潜伏期和错误次数来看,正常对照组明显优于移植生理盐水组,且都具有统计学意义;和移植生理盐水组比较,移植低剂量和高剂量组的潜伏期增加,移植低剂量组的错误次数减少,且有统计学意义,其余各组结果差异无统计学意义,具体结果见表4。

组别只数错误次数正常对照组100.90±0.74移植生理盐水组71.60±1.14移植低剂量组91.11±1.27移植中剂量组61.83±0.75移植高剂量组91.33±1.22

注:各组间比较差异无统计学意义。

组别只数潜伏期错误次数正常对照组10204.80±124.210.40±0.52△移植生理盐水组788.27±106.69*1.43±0.98*移植低剂量组9246.84±100.37△0.33±0.50△移植中剂量组6156.4±157.440.50±0.55移植高剂量组9271.70±84.90△0.67±1.41

注:*与正常对照组比较,P<0.05,△与移植生理盐水组比较,P<0.05。

3 讨论

具有多向分化潜能的脐带间充质干细胞被移植到小鼠体内可能分化成为神经干细胞,通过神经修复、重建,发挥延缓老年痴呆的作用。基底前脑是老年痴呆脑皮质下神经元丢失最严重的区域[7],该区域含有不同神经元,包括胆碱能神经元和GABA能神经元,这个区域的神经元通过隔-海马通路(主要以乙酰胆碱和GABA为递质)与海马相联系[8],神经元的缺失造成了老年痴呆小鼠学习记忆障碍[9]。脐带间充质干细胞移植分化成神经干细胞,继续分化成为神经元,补充了老年痴呆小鼠基底前脑中神经元的损失,阻碍了老年痴呆症的病程发展。

在研究工作进行中,对老年痴呆症的动物模型的选择也有很多。研究表明[10],使用乙酰胆碱M受体阻断剂也可以制造出老年痴呆动物模型,该模型可造成认知障碍,但缺陷在于缺乏老年痴呆的特殊病理特征,且阻断是可逆的。APP转基因小鼠模型是国际承认的主要AD动物模型之一[11],它的原理是将APP基因或基因片段整合插入小鼠的基因组中,通过APP蛋白在小鼠大脑中积累从而产生老年斑,造成小鼠老年性痴呆,但由于整合的基因突变位点及启动子的不同,所以鼠系背景复杂,导致标准不尽相同,重复性低,最主要的还是该模型动物价格比较昂贵。有些实验使用电损毁模型或外科损毁模型,电损伤Meynert基底核,致使动物的大脑皮层乙酰胆碱的含量大大减少,从而造成动物学习记忆障碍[12],但是由于这种手术损伤较大,目前已经很少使用。以上这些方法都有其自身的缺陷,或模型不稳定、或不能完全模拟老年痴呆症的发病过程、或价格昂贵成功率不高,在实际操作中,都不易达到本实验的要求。

快速老化小鼠(SAM)是日本京都大学Takeda等人通过对AKR/J系小鼠进行筛选得到的品系,可分为2个亚系,即P系和R系。P系称为快速老化小鼠(SAMP),小鼠慢慢出现脱毛、皮肤粗糙、行为障碍及生存期短等衰老现象,并有明显遗传倾向;R系称为抗快速老化小鼠(SAMR),有类似正常老鼠的衰老过程[13]。目前有12个亚系的SAM用于研究,其中SAMP8小鼠的老化现象主要以学习记忆功能呈增龄性衰退,中枢神经系统如皮层、海马等部位发生病理学改变为主[14-15]。研究表明,SAMP8小鼠在饲养过程中脑内β淀粉样肽(Aβ)慢慢的出现沉积[16],而且学习记忆功能相关的脑内神经递质也逐渐发生改变,如大脑皮层和海马的乙酰胆碱、去甲肾上腺素的含量降低,阿片肽、γ-氨基丁酸的含量升高,5-羟色胺的含量先升高后降低等[17-18]。SAMP8小鼠脑内脂质过氧化物的水平比同龄SAMR1小鼠更高,同时伴有氧化-抗氧化系统紊乱,从而出现氧化应激损伤[16,19],更有明显的线粒体功能紊乱现象[20]。所以我们选择SAMP8小鼠。

本实验所选择的SAMP8小鼠在4月龄即出现明显的老化征象[21],而且在其成熟期(4～6个月)过后发生快速老化,学习记忆能力也表现出增龄性减退,随着衰老的发生,SAMP8模型小鼠表现出严重的学习记忆功能障碍。实验中通过尾静脉向7月龄SAMP8老年痴呆小鼠移植高中低3个剂量的HUMSCS,45 d利用MORRIS水迷宫和跳台实验检测其学习记忆能力,并设立生理盐水组和R1小鼠正常对照组,结果发现与R1正常对照小鼠比较,SAMP8老年痴呆小鼠生理盐水组学习记忆能力明显降低,细胞移植各组小鼠学习记忆能力介于生理盐水组和正常对照组之间,其中尾静脉细胞移植低剂量组与尾静脉生理盐水组比较,差异具有统计学意义,所以认为低剂量的HUMSCS移植对老年痴呆小鼠的学习记忆能力有改善作用。

以高中低3个剂量(2.5×105/0.2 mL/20 g、5×105/0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g)的HUMSCS分别向SAMP8老年痴呆小鼠移植后,细胞移植高剂量组的SAMP8小鼠的逃避潜伏期、不同象限的停留时间、跳台实验中的错误次数及最后小鼠体重等指标都不如移植低剂量的效果好,推测可能是由于细胞浓度过高,且直接移植到动脉造成动脉栓塞,导致SAMP8小鼠状态不佳,其具体原因仍需要实验作为依据,后续实验会继续探究其原因。

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(2015-05-18收稿 责任编辑：王明)

Effects of HUMSCs on Learning Ability and Memory in Mice SAMP8 with Alzheimer's Disease

Zhou Huifang1, Zhang Mixia2, Gao Li2, Zhuang Pengwei2, Xu Qian1, Zhang Yanjun2

(1SchoolofIntegrativeMedicine,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China; 2SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China)

Objective: To explore the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells(HUMSCSs) on the learning ability and memory of mice SAMP8 with Alzheimer's disease. Methods: We cultivated human umbilical cord mesenchymal stem cells, provided three doses HUMSCs (2.5×105/0.2 mL/20 g, 5×105/0.2 mL/20 g, 1×106/0.2 mL/20 g) for the transplantation of seven months SAMP8 Alzheimer's mice by the tail vein, and set up the normal saline group and normal control group R1 mice for comparison. After 45 days, MORRIS water maze and jumping apparatus were used to test the ability of learning and memory of the subjects. Results: Compared with normal control mice R1, normal saline group of SAMP8 Alzheimer's mice performed significantly worse on the learning and memory tests. But there was significant improvement in Morris water maze test compared with the normal saline group, including shorter escape latency (P<0.05) more platform crossing frequencies (P<0.05), and in jumping apparatus including less jumping stand error number (P<0.05) and longer step down latency (P<0.05). Conclusion: Low dose of HUMSCs can enhance learning and memory ability of SAMP8 Alzheimer's mice.

HUMSCs; Transplantation; SAMP8; Learning and memory

天津市科技支撑计划重大项目(编号:08ZCKFSF03200)

周会芳(1987.2—),女,硕士,助理实验师,研究方向:中药药效评价,E-mail:zhouhuifanghhfm@163.com

张艳军(1967.8—),男,博士,教授,研究方向:中药药理,E-mail:zyjsunye@163.com

R229;R394-3

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.024