芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜核因子-κB DNA结合活性的影响

罗敏 李帅军 胡响当 王晓艳 林仁敬 杨周雨

湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，湖南长沙410005

芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜核因子-κB DNA结合活性的影响

罗敏 李帅军 胡响当 王晓艳 林仁敬 杨周雨

湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，湖南长沙410005

目的研究芍药汤对胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠核因子-κB（NF-κB）DNA结合活性的影响。方法将40只SD大鼠随机分为4组：正常组，模型组，芍药汤组，柳氮磺胺吡啶（SASP）组。制备胃肠湿热型模型，然后采用三硝基苯磺酸（TNBS）制备灌肠法溃疡性结肠炎模型，灌胃治疗10 d后处死大鼠，取新鲜结肠黏膜标本提取核蛋白，利用以酶联免疫吸附测定（ELISA）为基础的Trans AMTMNF-κB P65试剂盒检测各组NF-κB相对活性。结果与正常组比较［（0.263±0.041）］，模型组大鼠NF-κB相对活性明显增高［（0.467±0.083）］，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，芍药汤组大鼠结肠黏膜NF-κB相对活性明显降低［（0.271±0.089）］，差异有高度统计学意义（P＜0.01)。结论芍药汤能明显降低胃肠湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型结肠黏膜NF-κB相对活性，可能是其治溃疡性结肠炎作用的机制之一。

芍药汤；胃肠湿热；溃疡性结肠炎；核因子-κB

溃疡性结肠炎（UC）的病因和发病机制迄今尚未明确，其中免疫因素在此病中所起的作用越来越受重视，研究已深入到细胞分子水平，特别是近年来研究发现核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）调控着UC患者中细胞因子和细胞黏附分子（cell adhesionmolecules，CAM）的释放，从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应。芍药汤出自《素问病机气宜保命集》，具有清热燥湿、调气和血的功效，根据多年的临床研究，对于胃肠湿热型UC，具有良好的疗效，为求进一步明确芍药汤干预UC调节作用机制，本实验通过检测NF-κB的DNA结合活性，从基因水平探讨芍药汤干预UC的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠40只，体重180～220 g，购自湖南中医药大学动物实验室［合格证号：SCXK（湘）2011～0003］，动物适应性饲养1周。

1.2 实验器材

核蛋白提取试剂盒（武汉博士德生物公司）；BCA-100蛋白质定量测定试剂盒（西安晶彩生物科技有限公司）；Tarns AMTMNF-κB酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海齐一生物物技有限公司）；ZFMQ050PE型超纯水器（上海摩勒科学仪器有限公司）；3K-30Z型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）。

1.3 实验阳性对照药物与试剂

柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海福达制药有限公司，批号：201310001，每片0.25 g），三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma公司），药物用蒸馏水配成50 g/L。

1.4 实验用药的制备

芍药汤超微颗粒由芍药、当归、黄连、槟榔、木香、黄芩、大黄、肉桂、甘草9味药组成。组方超微颗粒由湖南春光九汇现代中药有限公司提供，然后在湖南中医药大学附属第二医院制剂科，将药物用蒸馏水制成含生药1.32 g/mL水剂。

1.5 实验方法

1.5.1 造模及分组将40只大鼠随机分为4组，每组各10只，正常组、模型组、芍药汤组、SASP组。除正常组外，其余3组首先参考文献［1-2］复制胃肠湿热模型：以高脂高糖饮食饲养大鼠，即在普通饲料喂养的基础上，加用200 g/L蜂蜜水自由饮用，每隔1 d按大鼠体重灌服油脂10 g/kg，并与油脂一起灌服10 mL/kg白酒，共10 d。然后再放入温度（32±2）℃，相对湿度为95%的人工气候箱中，共5 d。待胃肠湿热型模型造模成功后，再予以TNBS灌肠法制作UC大鼠模型。造UC模型前予禁食24 h，除正常组，其余各组大鼠先用乙醚麻醉，然后从肛门将大鼠灌胃针头轻轻插入，避免损伤肠道，深度约为8 cm，推入TNBS溶液（含25 mL/L TNBS和500 mL/L乙醇）4 mL/kg体重，捏紧肛门平放5 min即可，术后予以常规饲养。待造模4 d后，随机从每组中抽出1只处死并解剖，游离其结肠组织，用生理盐水洗净后，观察距肛门7～8 cm处见肉眼可辨溃疡面，病理检查发现充血、水肿、隐窝脓肿和典型的溃疡等形成，确定造模成功。

1.5.2 给药方法与标本留取确定造模成功后第2天，将大鼠按体表面积折算成成人等效剂量给药，芍药汤组折算后为含生药13.2 g/（kg·d），同理，SASP组折算后为0.5 g/（kg·d）。正常组和模型组大鼠用等体积量生理盐水经胃灌入。每组同时开始按上述剂量给药，1次/d，连续10 d。末次给药24 h后，以脱颈椎法将大鼠处死，提取距肛门8 cm结肠组织，并沿纵轴剪开，在结肠病变最明显处取0.5 cm结肠，以10%甲醛液固定、石蜡包埋，制成病理切片，HE染色后光镜下查看；余下部分刮取结肠黏膜组织，每只大鼠刮取50 mg新鲜结肠黏膜，立即提取核蛋白。利用以ELISA为基础的Trans AMTMNF-κB P65试剂盒检测各组NF-κB相对活性。

1.6 观察指标

①观察大鼠的体重、大便、食欲、活动度、精神状态等；②结肠大体病理及组织学改变:观察大鼠结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、等情况，观察黏膜有无水肿、糜烂、溃疡、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润等改变；③利用以ELISA为基础的Trans AMTMNF-κB P65试剂盒检测NF-κB的DNA结合活性。

1.7 统计学方法

应用SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

正常组大鼠体重、大便、饮食、活动均正常。其余3组大鼠在造模后3 d内均逐渐出现蜷缩、倦怠懒动、反应迟钝、拱背、便软、便溏等症状，有的黏液便甚至可见肉眼血便。造模第4天每组随机抽出一只处死后取结肠，除正常组外剩下各组结肠组织肉眼可见溃疡面。芍药汤组和阳性对照组在用药4 d以后，上述情况开始逐渐改善，进食量明显增加，伴随体重增加明显，到用药后期时，大便多呈颗粒状，黏液便、血便等基本消失。模型组后期血便等症状有所改善，但大便仍不成形并大便臭秽。

2.2 结肠大体病理及组织学改变

正常组大鼠肠黏膜上皮细胞排列整齐，腺体结构规则，各层次构造清楚，没有发现炎症细胞及溃疡（图1 a，封三）。其余组所取结肠组织可见黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡，有的出现瘢痕形成，部分结肠扩张、黏膜皱襞变浅，以模型组最为严重（图1 b，封三）。SASP组和芍药汤组病变明显减轻，可见充血、水肿、糜烂和红色瘢痕（图1 c～d，封三）。

2.3 NF-κB活性

与正常组比较，模型组大鼠NF-κB相对活性明显增高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，芍药汤组大鼠结肠黏膜NF-κB相对活性明显降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

3 讨论

UC临床上主要以腹泻为主，排出含有血、脓和黏液的粪便，同时常伴有阵发性结肠痉挛性疼痛，并里急后重，排便后可获缓解。本实验中的大鼠在采用TNBS造模成功后均出现腹泻、黏液脓血便等症状，肠道主要表现为水肿、充血、糜烂，镜下可见大量中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润，在病理学和免疫学特征上与溃疡性结肠炎病患者相似［3-6］。溃疡性结肠炎是多种因素、多种机制相互作用的结果。同时研究还发现，各种细胞因子能够相互作用形成复杂的细胞因子网络，加重炎性反应，从而导致黏膜损伤，这在溃疡性结肠炎的发生发展中起着十分重要的作用［6-7］。

表1 大鼠结肠黏膜核因子-κB DNA结合活性（x±s）

有研究表明，许多与炎症和免疫反应关系密切的趋化因子、黏附因子等重要因子均含有κB位点，活化的NF-κB能与特定的κB位点结合，启动调节参与机体的炎症和免疫有关的基因转录，在机体的炎症、免疫方面发挥重要作用［9-13］。NF-κB是可跟γ-球蛋白轻链基因的增强子GGGACTTTCC（B序列）结合的一种核蛋白，它在基因表达的先天免疫反应、细胞增殖及分化中有重大作用，其中作为诱导UC发病的促炎因子如肿瘤坏死因子α、白介素6等，已被证实由核因子κB调节控制他们的转录水平，核因子κB的活化可以控制多种促炎因子的基因转录，这证明它在UC发病中的作用重大，UC发病时NF-κB呈过激活状，放大炎性反应［13-18］。

芍药汤出自《素问病机气宜保命集》，具有清热燥湿、调气和血的功效。在临床运用中，针对胃肠湿热型的UC能取得很好的治疗效果。方中黄芩、黄连性味苦寒，入大肠经，具有清热燥湿解毒的功效，以除致病之因，为君药。方中重用芍药养血和营、缓急止痛，再配以当归养血活血，体现了“行血则便脓自愈”之义，且可兼顾湿热邪毒熏灼肠络，伤耗阴血之虑；木香、槟榔行气导滞，“调气则后重自除”，四药相配，调和气血，是为臣药。大黄苦寒沉降，合芩连则清热燥湿之功著，合归、芍则活血行气之力彰，其泻下通腑作用可通导湿热积滞从大便而去，体现“通因通用”之法。方以少量肉桂，其辛热温通之性，既可助归、芍行血和营，又可防呕逆拒药，属佐助兼反佐之用。炙甘草和中调药，与芍药相配，又能缓急止痛，亦为佐使。诸药合用，湿去热清，气血调和，故下痢可愈。

本实验发现经芍药汤治疗过的胃肠湿热型UC大鼠，其结肠NF-κB的表达显著降低，可能是芍药汤阻断NF-κB的激活，减少NF-κB的活化诱导因素从而降低了NF-κB p65的表达，起到治疗UC的作用。

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Effect of Peony Decoction on DNA binding activity of NF-κB in colonic mucosa of gastrointestinal syndrome with ulcerative colltis rats

LUO Min LI Shuaijun HU Xiangdang WANG Xiaoyan LIN Renjing Y ANG Zhouyu
Department of Anorectal,the Second Affiliated Hospital of Hu'nan University of Chinese Medicine,Hu'nan Province, Changsha 410005,China

ObjectiveTo observe the effect of Peony Decoction Decoction on DNA binding activity of NF-κB in colonic mucosa of gastrointestinal syndrome with ulcerative colltis rats.Methods40 rats were randomly divided into four groups,normal group,model group,Peony Decoction group,SASP group.Gastrointestinal syndrome rat model was prepared,then ulcerative colltis ratmodelwas made by trinitrobenzene-sulfonic acid(TNBS).The rats were killed to getfresh colonic mucosa and extract nuclear proteins after 10 days of treatment.Relative activity of NF-κB was detected by ELISA with a Trans AMTMNF-κB p65 kit.ResultsCompared with normal group［(0.263±0.041)］,the relative activity of NF-κB was significantly higher in modelgroup［(0.467±0.083)］,the difference was statistically significant(P＜0.01);compared with model group,the relative activity of NF-κB was significantly lower in Peony Decoction group［(0.271±0.089)］, the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionPeony Decoction can inhibit the relative activity of NF-κB in colonic mucosa of gastrointestinal syndrome with ulcerative colltis rats.The inhibitory effect of Peony Decoction on ulcerative colltis maybe associate with the inhibition of NF-κB activity.

Peony Decoction;Gastrointestinal syndrome;Ulcerative colitis;Nuclear factor-κB

R574.62；R-332

A

1673-7210(2015）01(c）-0004-03

2014-10-19本文编辑：苏畅）

湖南省教育厅重点学科中医外科学项目（编号：湘教发［2011］76号）；湖南中医药大学青年教师科研基金课题（编号201346）。