七叶皂苷钠对脑缺血再灌注损伤大鼠炎性细胞因子的影响

张雪梅，骞秀芳

七叶皂苷钠对脑缺血再灌注损伤大鼠炎性细胞因子的影响

张雪梅1，骞秀芳2

目的 观察七叶皂苷钠对脑缺血再灌注(CI/R)损伤大鼠脑组织中炎性细胞因子的影响，探讨其作用机制。方法 采用四血管阻塞10 min的方法建立CI/R大鼠模型，并进行12 h再灌注，试验分为假手术组、模型组及七叶皂苷钠高、中、低剂量组(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，术前3 d开始腹腔注射给药，每天1次，术后1 h给药1次。再灌注12 h后，ELISA法检测脑匀浆中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平。结果 七叶皂苷钠高、中剂量可显著降低CI/R损伤大鼠的神经行为学评分，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。七叶皂苷钠各剂量均能降低CI/R损伤大鼠脑组织的TNF-α水平，高、中剂量可明显降低脑组织IL-1β的表达水平，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 七叶皂苷钠预处理对CI/R损伤大鼠的脑保护作用可能与其减少炎性细胞因子的过度释放有关。

脑缺血再灌注损伤； 七叶皂苷钠；肿瘤坏死因子-α；白介素-1β

脑缺血再灌注(CI/R)损伤约占脑血管损伤原因的60%，防治由CI/R引起的脑血管损伤具有重要的临床意义[1]。近年来对CI/R损伤的研究取得了较大进展，但迄今临床上仍缺乏理想的治疗药物。七叶皂苷钠(Sodium aescinate)是由七叶树果实娑罗子中提取的三萜皂苷钠盐。研究表明，七叶皂苷钠具有抗炎、抗渗出、消水肿以及改善血液循环等作用[2-3]。据报道，七叶皂苷钠对CI/R损伤具有确切的保护作用[4]，然其作用机制仍不清楚。本研究探讨七叶皂苷钠对CI/R损伤大鼠炎性细胞因子的影响，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重240 g～280 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。动物分笼饲养，适应性喂养1周后进行试验。

1.2 药品和试剂 注射用七叶皂苷钠，购自北京四环科宝制药有限公司。大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 光学显微镜，日本奥林巴斯公司产品；电子匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；高速冷冻离心机，中国科大创新股份有限公司产品；紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.4 CI/R损伤大鼠模型的制备 采用四血管阻塞法建立全脑缺血再灌注动物模型[5]。取SD大鼠，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，颈中切口，分离第一颈椎双侧的横突孔，电凝双侧椎动脉并分别用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，10 min后恢复血流灌注，常规缝合颈部切口，再灌注12 h。造模成功标准：夹闭颈总动脉后30 s～60 s内动物昏迷，睫毛反射消失，瞳孔放大，眼球变白，松开动脉夹后20 s～30 s，眼球恢复红色，意识恢复，并可以活动。剔除术后出现意外的大鼠，如诱发癫痫、肢体瘫痪、意识障碍、死亡等，并予以补齐。

1.5 分组和给药 取成模大鼠40只，随机分为：模型组，七叶皂苷钠低、中、高剂量组(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，每组10只。另取10只大鼠，不电凝双侧椎动脉，也不夹闭双侧颈总动脉，其余操作同成模大鼠，作为假手术组。术前3 d各组开始腹腔注射给药，均按10 mL/kg每天给药1次，术后1 h给药1次，假手术组和模型组按等体积给予生理盐水。

1.6 指标检测

1.6.1 神经行为学评分 再灌注10 h后，按文献方法对各组大鼠进行神经行为学评分[6]，包括运动、感觉、反射以及平衡试验，最低0分，最高18分，1分～6分为轻度损害，7分～12分为中度损害，13分～18分为重度损害。

1.6.2 脑匀浆TNF-α和IL-1β的检测 再灌注12 h后，各组动物断头，取脑部，在冰浴生理盐水中漂洗除血，滤纸拭干，称重，电动匀浆机研磨，加冰浴生理盐水制成10%脑匀浆，冷冻离心机中5 000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA法测定TNF-α和IL-1β的表达水平，操作按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 七叶皂苷钠对CI/R损伤大鼠神经行为学评分的影响 假手术组评分为0，不纳入统计学比较。模型组评分为(7.04±1.19)分，七叶皂苷钠高、中剂量可分别降低神经行为学评分为(6.24±0.95)分、(6.29±0.87)分，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 七叶皂苷钠对CI/R损伤大鼠脑组织TNF-α和IL-1β水平的影响 模型组大鼠脑组织匀浆中TNF-α和IL-1β水平均显著高于假手术组(P< 0.01)。七叶皂苷钠各剂量均能降低CI/R损伤大鼠脑组织的TNF-α水平，与模型组比较差异有统计学意义(P< 0.05)。七叶皂苷钠高、中剂量均明显降低CI/R损伤大鼠脑组织IL-1β的表达水平(P< 0.05)，与模型组比较差异有统计学意义(P< 0.05)。详见表1。

表1 七叶皂苷钠对CI/R损伤大鼠TNF-α和IL-1β的影响(±s) μg/(g·Pro)

3 讨 论

近年来，药物预处理是防治CI/R损伤提出的新理念，通过药物预处理阻断神经元损伤的病理生理环节，增加机体内源性保护物质，在CI/R损伤的防治中具有重要意义[7]。本研究采用术前3 d开始给药的预处理方式，观察七叶皂苷钠对CI/R损伤大鼠的脑保护作用，结果显示七叶皂苷钠各剂量明显降低了CI/R损伤大鼠的神经行为学评分，说明七叶皂苷钠预处理能减轻CI/R损伤的神经症状，具有一定的神经保护作用。急性炎症反应是CI/R中引发继发性脑损伤的主要原因之一[8]。TNF-α和IL-1β是机体炎症反应和免疫应答的重要细胞因子，CI/R发生时由神经元、神经胶质细胞、血管内皮细胞和血管周围的炎性细胞分泌产生，过度表达的TNF-α和IL-1β可触发炎症反应，启动多种介质的级联反应，加重脑组织损害[9-10]。陈素辉等[11]研究表明，CI/R大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β的表达在再灌注12 h～144 h后均有所升高，且显著高于假手术组和正常组。因此，抑制炎症介质的过度产生，对于改善CI/R损伤有着重要意义。

本研究结果显示，CI/R损伤大鼠在再灌注12 h后脑组织中TNF-α和IL-1β的表达水平有显著升高，提示炎性因子的释放参与了CI/R损伤的病理过程，这与文献报道[9-11]的结果一致。七叶皂苷钠各剂量均能下调CI/R损伤大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β的表达，并能缓解神经行为学症状，提示七叶皂苷钠的作用机制可能是通过抑制炎症介质如TNF-α和IL-1β的表达，从而减轻炎症级联反应，实现对CI/R损伤的脑保护作用。

七叶皂苷钠预处理对CI/R损伤大鼠的保护作用是通过下调脑组织中TNF-α和IL-1β等炎症因子的表达、减轻脑组织的炎症反应等途径实现的。

[1] Wu PF，Zhang Z，Wang F，et al.Natural compounds from traditional medicinal herbs in the treatment of cerebral ischemia/reperfusion injury [J].Acta Pharmacol Sin，2010，31(12)： 1523-1531.

[2] Wang YK，Han J，Xiong WJ，et al.Evaluation of in vivo antioxidant and immunity enhancing activities of sodium aescinate injection liquid [J].Molecules，2012，17(9)： 10267-10275.

[3] 李焱燚，王永刚，刘学源.β-七叶皂苷钠的研究进展[J].神经病学与神经康复学杂志，2009，6(2)：147-150.

[4] 蒋珍秀，刘宁，谷有全，等.七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤脑的保护作用[J].兰州大学学报(医学版)，2011，37(2)：5-9.

[5] Costa C，Zhao L，Shen Y，et al.Role of complement component C5 in cerebral ischemia/reperfusion injury [J].Brain Res，2006，1100(1)： 142-151.

[6] Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats [J].Stroke，1990，21(5)： 801-807.

[7] 丁宁，王芳，肖慧，等.维拉帕米预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究[J].南方医科大学学报，2007，27(7)：1061-1064.

[8] Wong CH，Crack PJ.Modulation of neuro-inflammation and vascular response by oxidative stress following cerebral ischemia reperfusion injury [J].Curr Med Chem，2008，15(1)： 1-14.

[9] Fassbender K，Rossol S，Kammer T，et al.Proinflammatory cytokines in serum of patients with acute cerebral ischemia： kinetics of secretion and relation to the extent of brain damage and outcome of disease [J].J Neurol Sci，1994，122(2)：135-139.

[10] Saito K，Suyama K，Nishida K，et al.Early increases in TNF-α，IL-6 and IL-1β levels following transient cerebral ischemia in gerbil brain [J].Neurosci Lett，1996，206(2-3)：149-152.

[11] 陈素辉，孙华，徐虹，等.针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠双侧脑组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].针刺研究，2012，37(6)：470-475.

(本文编辑 王雅洁)

法令条例著录格式

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如：[1] 全国人民代表大会常务委员会.中华人民共和国著作权法[S].1990-09-07. [2] 中华人民共和国国务院.出版管理条例[S].2001-12-15. [3] 国家科委，新闻出版署，第12号令.科学技术期刊期刊管理办法[S].1991-07-01.

Influence of Sodium Aescinate on Inflammatory Cytokines in Rats with Cerebral Ischemia/reperfusion Injury

Zhang Xuemei，Qian Xiufang Beijing Armed Police Forces Hospital， Beijing 100027，China

Corresponding Author：Qian Xiufang(The Second Hospital of Beijing Armed Police Forces， Beijing 100027，China)

Objective To investigate the effect of sodium aescinate (SA) on inflammatory cytokines in rats with cerebral ischemia/reperfusion (CI/R) injury.Methods Rat model of CI/R was prepared by four-vessel occlusion for 10 min followed by 12-hour reperfusion.Rats were then randomly divided into 5 groups (n=10)，namely sham group， model group，SA high，medium and low dose groups (10，20 and 40 mg/kg).Drugs were i.p.administered once a day for 3 days before the operation and once 1 hour after the operation，respectively.The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α)， interleukin (IL)-1β in brain tissue homogenate were measured by ELISA after 12-hour reperfusion.Resluts The neurological behavior scores in SA high dose group and SA medium dose group were lower than that in model group(P<0.05).The levels of brain TNF-αin SA groups were significantly lower than that in model group (P<0.05).The levels of brain IL-1β in SA high dose group and SA medium dose group were lower than that in model group(P<0.05). Conclusion SA pretreatment can inhibit inflammatory cytokines in brain tissue in rats with CI/R injury.

sodium aescinate；cerebral ischemia/reperfusion injury； tumor necrosis factor-α；interleukin-1β

1.武警北京总队医院(北京 100027)；2.武警北京总队第二医院

骞秀芳，E-mail：158130707@qq.com

R743 R285

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.009

1672-1349(2015)17-1943-03

2015-02-26)