星点设计-效应面法优化盐酸普萘洛尔凝胶处方基质*

杨柳，王爱武，徐广琪，霍然

星点设计-效应面法优化盐酸普萘洛尔凝胶处方基质*

杨柳1，王爱武2，徐广琪3，霍然3

(1.山东中医药大学，济南 250355；2.山东大学附属省立医院药剂科，济南 250021；3.山东大学附属省立医院烧伤整形科，济南 250021)

目的 对盐酸普萘洛尔凝胶处方基质进行优化。方法 在单因素实验的基础上，采用星点设计-效应面法，以处方中影响较为显著的甘油(A)、聚乙二醇-400(B)、羟丙甲纤维素(C)的加入量为考察因素，高效液相色谱法测定盐酸普萘洛尔8 h单位面积累积透过量为考察指标，用二次多项式模型描述考察指标和3个考察因素之间的数学关系，绘制效应面和等高线图，确定较优处方基质并进行验证。结果 优选的基质处方为甘油18.53%、聚乙二醇-400 8.54%、羟丙甲纤维素2.35%，单位面积累积透过量的二次多元回归模型：R1=-7 415.69+306.10A+167.47B+4 820.59C-8.26A2-9.81B2-1 025.75C2，累积透过率约为49.6%。结论 通过星点设计-效应面法得到盐酸普萘洛尔凝胶处方基质优化模型，制备的盐酸普萘洛尔凝胶性质稳定、质量可控。

普萘洛尔，盐酸；凝胶；星点设计-效应面法；色谱法，高效液相

普萘洛尔为非选择性β-受体阻断药，临床上主要用于治疗心绞痛、心律失常、高血压等疾病[1]。2008年研究发现普萘洛尔可用于血管瘤的治疗[2]，临床研究表明口服普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤有效[3]，能够促进瘤体萎缩变薄。口服普萘洛尔有可能导致低血糖、低血压等不良反应[4-5]，首关效应强，生物利用度低。因此，将普萘洛尔透皮给药并直接作用于血管瘤患处，给药方便，减少不良反应。目前，常用的透皮给药剂型包括软膏剂、凝胶剂、贴剂、气雾剂等。凝胶剂是一类含有溶解、混悬或乳剂型状态药物的乳胶稠厚液体或半固体制剂，涂布以后可形成一层薄膜，具有定点给药、局部渗透、不污染衣物、易于除去、无皮肤刺激性的特点。因此，本实验将普萘洛尔做成凝胶剂型，以避免其肝脏首关效应，增加局部浓度，增强疗效。

星点设计(central composite design，CCD)是国内外近年来集数学和统计学方法于一体的实验设计方法，是由二水平析因设计加轴点及中心点组成，多采用三因素五水平非线性拟合。与单因素实验、正交设计和均匀设计等线性模型相比，具有精度高、预测性好、实验次数较少等优点[6-11]。笔者在本实验中采用星点设计-效应面法对盐酸普萘洛尔凝胶剂的基质处方进行优化，旨在得到稳定性好、质量可控、透皮性能良好的盐酸普萘洛尔凝胶剂。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 动物 健康Wistar大鼠，体质量175～225 g，雌雄各半，无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级，购自山东大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)2013-0107。实验室温度(25±1) ℃，相对湿度60%。

1.2 试药 盐酸普萘洛尔对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100783-200401，含量≥98%)；盐酸普萘洛尔原料药(湖北兴银河化工有限公司，批号：20110712，含量≥99%)；羟丙甲纤维素(hydroxy-propyl methyl cellulose，HPMC，曲阜市药用辅料有限公司，批号：20130101)；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、三乙胺、磷酸、氯化钠、氯化钾、乙醇、甘油、聚乙二醇-400(PEG-400)、羟苯乙酯均为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯。

1.3 仪器 Waters 600C高效液相色谱仪(Waters2487紫外检测器，Empowers色谱工作站)；ZTY智能透皮实验仪(河南省巩义市科瑞仪器有限公司，型号：TP-3A)；BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，感量：0.1 mg)；BSA223S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，感量：1 mg)；KQ-600DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ；FE20 型 pH 酸度计(梅特勒-托利多公司) 。

2 方法与结果

2.1 盐酸普萘洛尔凝胶的制备 称取处方量甘油、HPMC，加入研钵中研匀，加入适量纯化水充分溶胀得凝胶基质A；将处方量盐酸普萘洛尔溶于适量纯化水中得溶液B；将处方量的PEG-400和羟苯乙酯溶于乙醇中得溶液C。在搅拌状态下，缓慢向A中加入溶液B和C，边加入边搅拌至均匀，加纯化水至500 g，即得。

2.2 含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氢钾磷酸盐缓冲液(含0.1 %三乙胺，加磷酸溶液调pH值至3.5)= 37：63 ；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：290 nm；进样量：20 μL[11]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的盐酸普萘洛尔对照品9.8 mg，至 25 mL量瓶中，用pH值7.4磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)溶解并定容，摇匀，得浓度为392.0 μg·mL-1的盐酸普萘洛尔对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 称取普萘洛尔凝胶1 g，置于 10 mL 量瓶中加PBS稀释至近刻度线，超声至凝胶分散均匀，定容。所得溶液用内径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μL进样，记录峰面积，计算含量。同法制得空白辅料供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，4.0 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，分别用PBS稀释并定容，摇匀，精密吸取 20 μL进样，按“2.2.1”项色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，盐酸普萘洛尔对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归。线性方程为：Y=15 012X-9 261.5(r= 0.999 8)，结果表明，盐酸普萘洛尔在浓度为 7.84～156.8 μg·mL-1范围内有良好的线性关系。

2.2.5 精密度实验 取对照品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，重复进样6 次，测定盐酸普萘洛尔的色谱峰面积，结果峰面积的RSD为 1.18%，表明测试仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液分别在 0，2，4，8 h，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定盐酸普萘洛尔的色谱峰面积，结果峰面积的 RSD 为1.78%，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.2.7 回收率实验 取空白凝胶基质接收液6 份，分别精密加入盐酸普萘洛尔对照品适量，按“2.2.1”项色谱条件进行含量测定，计算回收率，结果平均回收率为99.37%，RSD为1.29%。

2.2.8 凝胶剂的含量测定 制备3批处方经优化后的含药量为2%凝胶。按“2.2.1”项下操作进行测定，结果见表1。

表1 盐酸普萘洛尔凝胶含量测定结果

Tab.1 Results of content determination on propranolol hydrochloride gel

%，n=3

2.3 体外透皮实验

2.3.1 离体皮肤的制备 将大鼠腹部用宠物剃毛刀进行脱毛，饲养1 d，保证脱毛部位皮肤无损伤。实验时取大鼠完整离体皮肤，用0.9%氯化钠溶液洗净，滤纸吸干，4 ℃冰箱短期保存，备用。

2.3.2 体外透皮实验 用滤纸吸干大鼠皮表面水分，角质层向上夹于扩散池中，在大鼠皮上均匀涂上不含药粉的空白凝胶基质及不同处方组成的盐酸普萘洛尔凝胶各0.2 g，接收池加入磁子并加满pH值7.4的PBS溶液。将扩散池置于(32.0±0.5) ℃的恒温水浴槽中，搅拌速度恒定。分别于1，2，4，6，8 h取出接收液15 mL，同时补加相同体积且等温的缓冲液。取出各时段的透皮接收液，用内径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μL进样，记录峰面积。

2.3.3 参数计算 按“2.2.1”项下色谱条件对接收液进行含量测定。通过外标法计算接收液中盐酸普萘洛尔的含量。含量测定后，按下式计算单位面积(cm2)药物累积渗透量(Q)：Q=[Cn·V+∑(Ci×15)]/S。其中，Q：药物单位面积经皮累积渗透量，S：有效皮肤渗透面积，V：接收池中接收液体积，Ci：第1次至上次取样时接收液中药物浓度，Cn：该次取样时接收液中药物浓度。

2.4 处方优化设计实验

2.4.1 因素水平 盐酸普萘洛尔凝胶剂的体外透皮吸收行为受诸多因素的影响。在单因素实验的基础上，根据星点设计-效应面原理，采用 Design-Expert实验设计软件(8.05b原版) 辅助设计，将影响较为显著的 3 个因素作为考察对象，5 个水平的代码分别为0，±1，±α，α=(F)1 /4，F=2k(k为因素数) 为析因设计部分实验次数。因素及水平见表 2。

表2 星点设计的因素水平表

Tab.2 Factors and levels of central composite design

%

2.4.2 星点实验结果 3个因素分别为甘油(A)、PEG-400(B)和HPMC(C)的量，优化指标R1为盐酸普萘洛尔单位面积累积通过量，其他组成和制备方法不变。具体实验设计及结果见表 3。

2.4.3 二次回归模型的建立 根据表3的结果，利用 Design-Export实验软件对实验数据进行回归分析，并以置信度(P) 作为模型判定的标准，建立数学模型，进行显著性检验，去掉对指标无显著性影响(P>0.05) 的项，得二次多元回归模型：R1=-7 415.69+306.10A+167.47B+4 820.59C-8.26A2-9.81B2-1 025.75C2。由回归方程的置信度(P<0.05)和复相关系数(R2=0.94) 可知，设计模型拟合程度良好，甘油 (A) 的用量及PEG-400(B) 的用量有极显著的影响，可以用此模型对盐酸普萘洛尔凝胶处方基质进行分析和预测。

表3 星点设计及结果

Tab.3 Central composite design and its results

15～20号为重复实验，数据以平均值表示data 15-20 of repetitive experiments were represented as mean

2.4.4 优化及预测 根据“2.4.2”项实验结果，采用Design-Export 8.05b软件绘制R1的预测等高线图及效应面图 (将其他一个自变量设为中心点值)，见图1。

根据所得拟合方程及效应面，软件给出优化处方工艺下各因素与指标的预测值，结果A为18.53%，B为8.54%，C为2.35%，R1为1 798.69 μg·cm-1。

2.4.5 最优处方工艺验证 按照以上优化处方工艺，制备 3批普萘洛尔凝胶剂，并对实际的单位面积累计透过量进行测算。结果实测值为1 680 μg·cm-1。将实测值(V实测) 与预测值(V预测)比较，偏差(%)=(V实测-V预测)/V预测×100%，偏差越小说明所建立的模型预测性越好，本实验偏差=6.60%，表明可预测性良好，累积透过率约为49.6%。

3 讨论

星点设计-效应面法在进行最优处方筛选时，效应与因素之间的关系可能是线性的，也可能是非线性的，表现在效应面上，线性的为平面，非线性的为曲面。在整个考察范围内，在距离较佳区域较远的地方接近线性，愈接近较佳区，面的弯曲度就越大，即在较佳区，非线性关系居多，从效应面上直接读取较佳工艺条件。本实验效应面显示，甘油和PEG-400对药物累积透过量的影响较大。

图1 累积透过量对各因素的预测等高线及效应面图

Fig.1 Predicted contour line and response surface of accumulative penetration amount versus other factors

在盐酸普萘洛尔凝胶剂制备过程中，比较羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠和HPMC的成形性。羧甲基纤维素钠由于受pH值影响较大，加入普萘洛尔药粉之后溶胀性变差，有白色索状物析出；聚丙烯酸钠加入水溶胀之后稠度很大，加入其他基质和药粉不易搅拌均匀，并且静置后气泡很难去除；HPMC可克服以上两种基质的缺点，因此对其进行单因素考察，当HPLC的含量超过3%时，制备的凝胶剂较稠，不易涂布且涂布不匀；含量过低时，制备的凝胶剂流淌性较大，不易成膜，确定其含量范围为2%～3%。甘油的加入量对HPMC的溶胀程度有显著影响，随着甘油量的加大，HPMC溶

胀由易变难，通过单因素考察可知其含量应控制在30%以内。

本实验以甘油、PEG-400、HPMC的加入量为因素，8 h单位面积累积透过量为指标，采用星点设计-效应面法优化盐酸普萘洛尔凝胶剂的最佳基质处方为甘油18.53%、PEG-400 8.54%、HPMC2.35%。由实验结果可知星点设计优化的实测值与理论值相差不大，制备的凝胶剂质量可控，透皮吸收性能较好。

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Formulation Optimization of Propranolol Hydrochloride Gels by Central Composite Design-Response Surface Methodology

YANG Liu1, WANG Aiwu2, XU Guangqi3, HUO Ran3

(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China；2.DepartmentofPharmacy,ProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250021,China；3.DepartmentofPlasticSurgery,ShandongProvincialHospital,ShandongUniversity,Jinan250021,China)

Objective To optimize the matrix formula of propranolol hydrochloride gels. Methods On the basis of single factor experiment, central composite design-response surface method was used to optimize the formula.Addition levels of glycerol (A), PEG-400 (B) and HPMC (C) were evaluated as the independent variables.Eight-hour accumulative penetration amount per unit area measured by HPLC was used as the index.Quadratic polynomial was used to estimate the relationship between the index and the independent variables, and to delineate response surface and overlay contour plots in order to select the optimal formulations.Finally, predicted responses were verified. Results The optimized formula consisted of 18.53% glycerol, 8.54% PEG-400 and 2.35% HPMC.The quadratic polynomial regression model of 8-h accumulative penetration amount per unit area:R1=-7 415.69+306.10A+167.47B+4 820.59C-8.26A2-9.81B2-1 025.75C2, and the cumulative transmittance was 49.6%. Conclusion A credible model is established by using central composite design-response surface method and the formula of propranolol hydrochloride gels is optimized and the gel is stable and controllable.

Propranolol hydrochloride；Gels；Central composite design response method；Chromatography, high performance liquid

2014-10-20

2014-12-20

*山东省科技发展计划(2013GSF11806)

杨柳(1989-)，女，山东济南人，硕士，研究方向：医院新制剂开发及临床药学研究。电话：(0)15269179795，E-mail：yangliu930901@163.com。

王爱武(1966-)，女，山东菏泽人，主任药师，硕士生导师，博士，研究方向：医院新制剂开发及临床药学研究。电话：(0)15168888315，E-mail：wangaw66@163.com。

R972.4；TQ460.6

B

1004-0781(2015)10-1343-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.022