利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓皱缩病毒(SCV)和草莓镶脉病毒(SVBV)

史芳芳

(新疆兵团第十二师农业科学研究所，新疆乌鲁木齐 830088)

利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓皱缩病毒(SCV)和草莓镶脉病毒(SVBV)

史芳芳

(新疆兵团第十二师农业科学研究所，新疆乌鲁木齐 830088)

[目的]通过对反应条件和参数的摸索与优化，建立多重RT-PCR检测方法，实现2种病毒的同时高效快速检测。[方法] 通过CTAB法与试剂盒提取RNA，以优质的总RNA为模板，进行梯度PCR，结合扩增内标的检测体系，建立多重RT-PCR检测方法。[结果] 建立了优化的SCV和SVBV的多重RT-PCR检测体系，可以对草莓田间植株进行快速稳定的病毒检测。[结论]该研究为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法，为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。

草莓病毒; 内标; 多重RT-PCR; 病毒检测

草莓种苗普遍感染病毒是草莓生产中的瓶颈问题，由于可侵染草莓的病毒经常复合侵染，因此草莓病毒病的田间症状表现极其复杂[1]。不同病毒病在草莓上可表现出相似的症状，而同种病毒病在不同条件下的症状也会出现很大差异，这给病害的田间诊断带来了极大的困难[2]。因此，建立快速、准确的草莓病毒检测技术具有重要的实际意义。目前新疆关于草莓病毒病的研究极少，对病毒种类、分布、发生程度及生物学特性等基础研究极为薄弱，病毒检测体系不健全，缺乏先进的种苗及种苗生产环节有效的病毒检测技术手段，脱毒种苗质量难以保证，退化严重，使用时间短，效益不高。有的生产单位未经检测就盲目从内地调种，劣质种苗不仅破坏了脱毒种苗的声誉，损害了农民的利益，还造成了一些病原菌的广泛传播和地区性的检疫病害传入[3]。因此，在已有试验技术的基础上，通过进一步改进试验方法，优化体系，建立起一套灵敏度高、准确性好、操作简便的病毒检测技术[4]。笔者针对草莓皱缩病毒(SCV)和草莓镶脉病毒(SVBV)2种病毒，以单一RT-PCR为基础，通过对反应条件和参数的摸索与优化，建立多重RT-PCR检测方法，实现2种病毒的同时高效快速检测，为草莓病毒检测提供一种方便、高效的分子生物学方法，为草莓无病毒苗的实际生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料草莓试材为新疆兵团十二师三坪农场种植的露地草莓品种达赛莱克特，此品种为该单位从外地引进，种苗未经检测种植于大田，采集疑似感染皱缩病毒的6株草莓植株叶片，进行病毒检测。取约50 mg幼叶为试验材料。

1.2 试验试剂RNA试剂提取盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD2000均购于上海生物工程有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1特异性扩增与参照引物设计。根据GenBank中SMoV( Genbank Accession No.AJ311875，AJ311876)、SMYEV( Genbank Accession No.D12517)、SCV( Genbank Accession No.AY005146.1)、SVBV( Genbank Accession No.NC001725)的基因组序列和文献分别设计和合成针对SMoV、SMYEV、SCV和SVBV 的引物( 表1)[5]。

为了验证扩增的阴性条带的真伪性，引用草莓肌动蛋白基因Actin( GenBank Accession No.AB116565)作为内部体系参照[6]。所用引物均由上海生物工程公司合成。引物序列见表1。

表1 SMoV、SMYEV、SVBV、SCV和Actin检测所用引物

1.3.2核酸提取。

1.3.2.1利用改进的CTAB法提取草莓叶片总核酸[7]。取少许幼嫩叶片，放入1.5 ml离心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均匀，直至全部研磨至粉末，加入500 μl 65 ℃预热的CTAB溶液(用前加入2%的巯基乙醇)，将装有CTAB和样品的EP管放入65 ℃水浴，约20 min。冷却后，加入500 μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，12 000 r/min，离心15 min，吸上清，装入一新的EP管。加入500 ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，12 000 r/min，离心15 min，吸上清，转入一新的离心管中。加入1/10体积的NaAc(3 mol/L)，1 ml -20 ℃预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于-20 ℃(-80 ℃，30 min)3～4 h，12 000 r/min，10 min，弃上清。向离心管中加入75%的乙醇洗涤2～3次，置于吸水纸上倒置晾干。加入DEPC H2O(30 μl)溶解。

1.3.2.2试剂盒提取总RNA。总RNA的提取参见试剂盒说明书进行。

1.3.3反转录。按照试剂盒说明书进行反转录。

1.3.4梯度PCR扩增内参。以反转录产物为模板，进行单一PCR扩增。PCR体系：10×PCR缓冲液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 1 μl，Taq酶0.5 μl，反转录产物0.5 μl，补足双蒸水至20 μl。

反应程序：预变性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 40 s，68 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.5多重RT-PCR。

1.3.5.1双重RT-PCR扩增SCV。扩增体系：10×PCR缓冲液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 0.5 μl，SCVF/SCVR 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，反转录产物0.5 μl，补足双蒸水至20 μl。

反应程序：预变性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.5.2三重RT-PCR扩增其他3个病毒。扩增体系：10×PCR缓冲液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物SMoVF/SMoVR 0.72 μl，SVBVF/SVBVR 1 μl，SMYEVF/SMYEVF 0.6 μl，Taq酶0.5 μl，反转录产物0.5 μl，补足双蒸水至20 μl。

反应程序：预变性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

2 结果与分析

2.1 总核酸分离和电泳检测采用试剂盒提取总核酸，包括总DNA和总RNA。从琼脂糖凝胶电泳结果可以看出(图1)，DNA条带及RNA的28S、18S和5S条带均能看到，这说明总RNA没有发生降解，完整性较好。

2.2 内标RT-PCR以ActinF/ActinR为引物，采取草莓品种反转录产物为模板，梯度PCR扩增，筛选出53°为最佳退火温度，扩增出预期295 bp大小的特异片段(图2)，说明Actin基因存在于草莓中，该基因适合作为草莓RNA病毒检测的内标。以此基因为内标，一方面可以排除假阴性结果的干扰，另一方面可以进一步检测RNA质量，提高了检测结果的准确性。

2.3 多重RT-PCR以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR两对引物首先扩增疑似皱缩病毒，扩增条件同Actin基因，2个植株扩增出大小为345 bp的特异片段(图3)，说明检测出SCV病毒，此前预估带有此病毒的推测是正确的。

同时，以另外3种病毒引物继续扩增cDNA，确定植株是否还有其他病毒侵染，结果检测出片段大小278 bp的条带，说明存在镶脉病毒侵染(图4)，因此疑似植株可确定为皱缩病毒和镶脉病毒复合侵染，与皱缩病毒通常与草莓镶脉病毒(SVBV)复合侵染的说法一致。

图1 总核酸提取

图2 6个植株内参Actin 扩增

注：M.marker，A1、A2.Actin扩增条带，S1、S2.SCV扩增条带。图3 Actin/SCV引物扩增

注：M. marker， 1、2.SVBV扩增条带。图4 其他3引物扩增

3 讨论

(1)与改进CTAB法提取RNA 相比，该研究采用试剂盒提取，方法简单，只需30 min，提取效果也比改进的CTAB法好，而且改进的CTAB法提取配制试剂复杂，准备工作耗时长，对所用耗材及试剂要求均必须去除RNA酶污染，提取时间需要12 h，提取过程也较繁琐，一批次提取样品，提取效果均一性不好，有些样品提取条带完整，有些则效果较差，这说明提取过程稍不注意，则会有RNA酶污染，影响了提取效果[8]。

(2)植物病毒检测体系中引入内标可增加试验的可靠性，减少假阴性的出现。该研究设计了NADH脱氢酶基因为内参，合成引物后，经过多次条件摸索，始终扩增不出内参条带，之后换成Actin内参引物，经过梯度PCR扩增，一次便成功扩增出条带，该研究最终选择此基因作为内参，扩增效果较好，健康植株与带毒试材均可良好地扩增，说明此内标相对稳定[9]。

(3)多重PCR扩增受诸多因素影响，该研究首先以疑似病毒引物和内参引物作双重PCR扩增，确保了样本RNA质量的可靠性，同时验证了疑似病毒的检测结果，2次试验再进行三引物PCR扩增，以排除其他病毒的侵染，2次试验便可确保试验的准确无误，避免了单一引物扩增的繁琐性，因此，经过多重RT-PCR扩增可缩短试验时间，减少试剂的损耗，达到了省时省力的功效。同时，该研究在试验过程中尝试了采用一步法RT-PCR进行扩增，此方法可节省更多的时间和试验步骤，但此方法中间过程不易控制，且重复性不好，因此没有得到较好的试验结果，最终还是选择两步法PCR更能保证试验的准确性[10]。

[1] 王国平.我国草莓病毒种类鉴定研究初报[J].中国果树，1988(2)：32-34.

[2] 肖君泽，黄益鸿，姜放军，等.草莓病毒病及其脱毒与检测技术研究进展[J].江西农业学报，2010，22(8)：88-90.

[3] 常琳琳，张志宏.草莓病毒的简单、快速PCR检测[M]//中国园艺学会草莓分会，北京市农林科学院.草莓研究进展(三).北京：中国农业出版社，2009：83-88.

[4] 杨洪一，张志宏，李丽丽，等.利用多重RT-PCR技术检测草莓病毒的研究[J].植物病理学报，2007，37(5)：549-552.

[5] 随春，吴禄平，张志宏.利用PCR技术检测草莓镶脉病毒[J].园艺学报，2003，30(1)：82-84.

[6] 朱海生，花秀凤，陈敏氡，等.四种草莓病毒SMoV、SVBV、SCV、SMYEV多重RT-PCR检测[J].核农学报，2013，27(11)：1630-1635.

[7] 张志宏，杨洪一，代红艳，等.应用多重RT-PCR检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒[J].园艺学报，2006，33(3)：507-510.

[8] 王红，王菁菁，张科立，等.利用内标为基础的多重RT-PCR 技术检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒[J]．浙江农业学报，2014，26(1)：105-109．

[9] 杨洪一，张志宏女，杜国栋，等.利用内标为基础的RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒[J].植物病理学报，2005，35(2)：116-122.

[10] 陈晓军，王敬东，马洪爱，等.利用RT- PCR 对脱毒草莓苗病毒检测研究[J].北方园艺，2010(23)：146-148.

Detection of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on Internal Control

SHI Fang-fang

(The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi,Xinjiang 830088)

[Objective] Through optimization of reaction conditions and parameters, multiple RT-PCR detection method was established in order to realize efficient and rapid detection of two kinds of virus. [Method] By CTAB method and the kit, RNA was extracted. Using high-quality total RNA as a template, gradient PCR was done, Combining with internal amplification target detection system, a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established. [Result] A multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established, and could make fast and stable virus detection in field grown strawberries. [Couclusion] The study provided a convenient and efficient molecular biology method for strawberry virus detection, and provided technical support for actual production of strawberry virus-free seedling.

Strawberry virus; Internal control; Multiplex RT-PCR; Virus detection

新疆生产建设兵团科技支疆计划项目(2013AB006)。

史芳芳(1977-)，女，新疆乌鲁木齐人，助理研究员，硕士，从事植物组织培养及农业技术推广工作。

2015-08-07

S 41-33

A

0517-6611(2015)28-020-02