骨质疏松肾阳虚病证结合模型构建的实验研究*

陈剑磨 张胜军 夏炳江

（浙江省绍兴市中医院，浙江 绍兴 312000）

·研究报告·

骨质疏松肾阳虚病证结合模型构建的实验研究*

陈剑磨 张胜军 夏炳江△

（浙江省绍兴市中医院，浙江 绍兴 312000）

目的研究建立骨质疏松肾阳虚病证结合模型的方法。方法雌性昆明小鼠随机分为对照组（A组）、证型模型组（B组）、疾病模型组（C组）、疾病证型模型组（D组）。分别应用去双侧卵巢法构建骨质疏松模型，氢化可的松皮下注射诱导肾阳虚证模型。通过观察小鼠症状体征、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、骨密度、骨组织形态学等评价模型。结果与A组比较，D组小鼠出现毛发干枯，畏寒倦卧，肛温降低等肾阳虚症状，促肾上腺皮质激素及促甲状腺激素含量降低（P＜0.01），环磷酸腺苷/环磷酸鸟苷降低（P＜0.01），股骨近端、腰椎骨密度下降（P＜0.01），HE染色及骨组织形态计量学分析显示骨小梁排列稀疏、变细，破骨细胞数增多等。结论采取双侧卵巢切除结合氢化可的松皮下注射的方法，能成功构建骨质疏松肾阳虚病证结合模型。

骨质疏松 肾阳虚 病证结合 动物模型

研究人类或动物的疾病，应在获得相应疾病动物模型基础上，开展探索致病机制的基础研究，根据获得的相关信息确定最终诊治方案［1］。建立合理、规范的疾病模型能有效地研究疾病的发生、发展，研究病因和寻求治疗方案。病证结合动物模型融合中医证候模型和现代医学病理学模型的共同因素和特点，使动物模型同时具有疾病与证候特征［2］，该类模型是阐明中医学基础理论和辨证论治较为理想的载体。根据病证结合的理念，本研究拟采用疾病模型复合证候模型的方法构建肾阳虚证骨质疏松症模型，为进一步研究中医药防治骨质疏松奠定良好的实验基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、药物与试剂 全自动组织脱水机（日本樱花），轮转式切片机（德国Leica），显微镜及显微拍摄系统（德国Leica），高速冷冻离心机（德国Eppendorf），全自动酶标仪（美国Thermo），多光谱小动物活体成像仪（美国Carestream Health），BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）；氢化可的松注射液（天津金耀氨基酸有限公司，生产批号1112231）；促肾上腺皮质激素（ACTH）、促甲状腺激素（TSH）、环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所提供）。

1.2 动物 清洁级雌性昆明小鼠60只，体质量（20± 2）g，所有小鼠均由浙江中医药大学实验动物中心提供（实验动物号SYXK-浙-2008-0115），每笼5只，喂食普通颗粒饲料，室温（20±2）℃，自然光照，保持良好通风，自由进水进食。

1.3 分组与造模 60只昆明小鼠随机分为2大组，分别进行假手术和去双侧卵巢手术。假手术后存活小鼠随机分为对照组（A组）和证型模型组（B组）；去双侧卵巢手术后存活小鼠随机分为疾病模型组（C组）和疾病证型模型组（D组），每组15只。A组：行假手术，以作对照。B组：假手术后间隔7周，皮下注射氢化可的松1周。C组：行双侧卵巢去除术。D组：去双侧卵巢术后间隔7周，皮下注射氢化可的松1周。骨质疏松症模型采用去势法制作：10%水合氯醛溶液（0.3 mL/100 g）腹腔注射，麻醉满意后，小鼠俯卧位，在第3腰椎处备皮消毒，正中纵形切开皮肤约1 cm，钝性分离一侧肌肉，剪开腹膜，找到梅花状的卵巢，0号无菌丝线结扎并用眼科剪剪断输卵管，分离切除卵巢，分层缝合肌肉筋膜，滴入少量青霉素水溶液后缝合皮肤，同法切除对侧卵巢。A组手术同上，发现卵巢后仅切除与卵巢等量的脂肪后缝合皮肤。肾阳虚模型按25 mg/kg剂量，皮下注射氢化可的松来诱导，约1周［3］。肾阳虚型骨质疏松症模型由上述2种造模方法复合而成，即在骨质疏松症模型的基础上复合肾阳虚模型，当骨质疏松造模至7周时，开始肾阳虚造模，至8周时骨质疏松症及肾阳虚造模同时结束。实验过程中各组小鼠均无死亡情况出现。

1.4 观测指标 （1）动物症状、体征观察。采用量化分级方法连续观察造模后小鼠毛发光泽度、精神、活动状态、饮食、睡眠、二便等情况。根据以下10个症状和体征：毛发干枯、畏寒喜暖、大便稀溏、小便清长、卷缩弓背、精神萎顿、怠倦嗜睡、自主活动次数减少、抓取时抵抗性减弱、食欲不振。对各组小鼠进行评分，依据严重程度不同，分别记为正常（0~1分），轻（2~4分），中（5~ 7分），重（8~10分）4个等级，评分有2个非实验组的中医专业人士完成［7］。（2）动物体质量及肛温变化。采用电子天平称量动物体质量，每3日1次，每次称量时间为下午14：00~16：00。在每次称量前，利用专用肛温计测量小鼠肛温并记录。（3）血液学检测。10%水合氯醛将小鼠麻醉后，采用摘除眼球的方法取血，提取血浆和血清后，-20℃冰箱内保存。按Elisa试剂盒说明的检测方法，分别测定血浆环核苷酸cAMP、cGMP含量和血清ACTH、TSH的浓度。（4）骨密度测定。用10%水合氯醛将小鼠麻醉后，利用多光谱小动物活体成像仪对脊柱及股骨进行X线摄片，利用自带软件进行股骨近端及第2腰椎骨密度（bone density）测定。（5）骨组织形态学观察。将小鼠股骨、腰椎用4%多聚甲醛液固定2 d，14%EDTA液脱钙14 d，按常规脱水、透明、包埋、石蜡切片，厚约3~4 μm，常规HE染色，用显微镜在40、200倍镜下观察组织形态学变化情况，并利用BI-2000医学图像分析系统进行骨组织形态学计量分析，包括骨小梁平均宽度，骨小梁面积，成骨细胞数及破骨细胞数。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 症状、体征量化评分 见图1。A组和B组评分高于C组和D组。而且与A组比较，D组小鼠出现毛发干枯，畏寒倦卧，肛温降低等肾阳虚症状。

图1 各组症状、体征量化评分趋势图

2.2 小鼠体质量及肛温比较 见表1。与A组比较，B、D组体质量周平均增长量、平均肛温均降低（均P＜0.01）。与B组比较，D组体质量周平均增长量、平均肛温均降低（P＜0.01或P＜0.05）。与C组比较，D组体质量周平均增长量、平均肛温均低于降低（P＜0.01）。

表1 各组实验体质量及肛温比较（±s）

表1 各组实验体质量及肛温比较（±s）

与A组比较，*P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与C组比较，#P＜0.01。下同。

组别 n 造模后第1日（g）造模后2周（g）周平均增长量（g / w）平均肛温（℃）A组 1 5 B组 1 5 C组 1 5 4 4 . 2 8 ± 3 . 7 1 4 7 . 4 9 ± 3 . 4 5 1 . 6 0 ± 0 . 8 8 3 7 . 0 8 ± 0 . 2 4 4 4 . 4 3 ± 3 . 3 8 4 3 . 4 0 ± 3 . 3 9 -0 . 5 1 ± 0 . 6 3* 3 6 . 4 4 ± 0 . 3 3*4 5 . 0 8 ± 1 . 7 2 4 8 . 3 4 ± 2 . 1 3 1 . 6 3 ± 0 . 2 6 3 6 . 9 6 ± 0 . 2 6 D组 1 5 4 6 . 2 2 ± 2 . 2 2 4 2 . 5 4 ± 3 . 0 6 -1 . 8 4 ± 0 . 6 3*△△# 3 6 . 0 4 ± 0 . 1 7*△#

2.3 小鼠血清ACTH、TSH及血浆cAMP、cGMP含量比较 见表2，表3。与A组比较，B、D组促肾上腺皮质激素及促甲状腺激素含量、cAMP、cAMP/cGMP降低（均P＜0.01）。与B组比较，C组促肾上腺皮质激素及促甲状腺激素含量降低 （均P＜0.01），cAMP、cAMP/ cGMP升高 （均P＜0.01）；D组TSH含量、cAMP降低（均P＜0.01），cAMP/cGMP升高（均P＜0.01）。与C组比较，D组促肾上腺皮质激素及促甲状腺激素含量、cAMP、cAMP/cGMP均降低（均P＜0.01）。

2.4 小鼠股骨、腰椎骨密度变化比较 见表4。与A组比较，C、D组股骨近端、腰椎骨密度均下降（均P＜0.01），B组腰椎骨密度下降（P＜0.01）。与B组比较，C、D组股骨近端、腰椎骨密度均下降 （P＜0.01或P＜0.05）。与C组比较，D组股骨近端、腰椎骨密度均下降（均P＜0.05）。

表2 各组血清ACTH及TSH含量比较（±s）

表2 各组血清ACTH及TSH含量比较（±s）

组 别 n A C T H（n g / L） T S H（m I U / L）A组 1 5 2 5 3 . 6 1 4 2 ± 2 5 . 7 0 9 6 3 . 5 5 4 9 ± 0 . 4 1 8 9 B组 1 5 1 7 6 . 7 5 6 6 ± 2 4 . 8 1 3 3* 2 . 1 5 5 9 ± 0 . 3 4 8 4*C组 1 5 2 3 7 . 9 1 1 0 ± 3 6 . 6 9 9 3△ 3 . 3 4 0 6 ± 0 . 2 0 7 9△D组 1 5 1 5 5 . 3 2 8 0 ± 2 2 . 9 3 1 1*# 1 . 6 8 3 0 ± 0 . 3 2 3 4*△#

表3 各组血清ACTH及TSH含量比较（±s）

表3 各组血清ACTH及TSH含量比较（±s）

组别 n c A M P / c G M P c A M P（n m o l / L）c G M P（n m o l / L）A组 1 5 5 . 5 9 ± 1 . 6 7 B组 1 5 3 . 7 7 ± 1 . 1 1*C组 1 5 5 . 6 1 ± 1 . 8 8△3 1 . 9 8 ± 3 . 7 1 6 . 0 6 ± 1 . 4 2 2 5 . 8 0 ± 3 . 5 3* 6 . 3 8 ± 1 . 7 1 3 2 . 8 4 ± 4 . 7 5△ 6 . 0 4 ± 1 . 6 4 D组 1 5 4 . 5 7 ± 1 . 6 3*△#2 3 . 8 0 ± 4 . 4 4*△# 6 . 5 5 ± 1 . 9 3

表4 各组股骨及腰椎骨密度比较（g/cm3，±s）

表4 各组股骨及腰椎骨密度比较（g/cm3，±s）

与A组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与B组比较，△△P＜0.01，△P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05。下同。

组 别 n 股骨近端平均密度 腰2椎骨密度A组 1 5 1 0 . 0 2 ± 0 . 7 4 4 . 0 4 ± 0 . 2 1 B组 1 5 9 . 8 0 ± 0 . 6 8 3 . 8 6 ± 0 . 4 2*C组 1 5 8 . 0 2 ± 0 . 8 8**△ 3 . 3 5 ± 0 . 6 3**△D组 1 5 7 . 2 8 ± 0 . 4 6**△△# 3 . 1 5 ± 0 . 7 2**△△#

2.5 骨组织形态学改变比较 见表5。与A组比较，C、D组HE染色及骨组织形态计量学分析显示骨小梁排列稀疏、变细，成骨细胞、破骨细胞数增多等（P＜0.01或P＜0.05），B组骨小梁面积变小，成骨细胞数增多（P＜0.05）。与B组比较，C、D组HE染色及骨组织形态计量学分析显示骨小梁排列稀疏、变细，破骨细胞数增多等（P＜0.01或P＜0.05）。与C组比较，D组HE染色及骨组织形态计量学分析显示骨小梁排列稀疏、变细，破骨细胞数增多等（P＜0.05）。

表5 各组小鼠股骨骨组织形态计量学指标比较（±s）

表5 各组小鼠股骨骨组织形态计量学指标比较（±s）

组别 n 骨小梁平均宽度（μ m）骨小梁面积（%）成骨细胞数（个/ 0 . 4 m m2）破骨细胞数（个/ 0 . 4 m m2）A组 1 5 B组 1 5 C组 1 5 0 . 2 5 ± 0 . 0 4 0 . 8 6 ± 0 . 1 6 7 . 4 9 ± 1 . 4 7 1 . 5 4 ± 0 . 6 8 0 . 2 3 ± 0 . 0 3 0 . 7 8 ± 0 . 3 3* 6 . 8 1 ± 1 . 9 8* 1 . 5 9 ± 0 . 7 8 0 . 2 0 ± 0 . 0 8*△ 0 . 6 5 ± 0 . 2 3**△ 7 . 7 5 ± 1 . 2 2*△△ 3 . 0 6 ± 1 . 5 6**△D组 1 5 0 . 1 9 ± 0 . 0 7**△△# 0 . 4 9 ± 0 . 1 7**△△# 7 . 6 2 ± 1 . 3 5*△△# 3 . 6 7 ± 1 . 4 5**△△#

3 讨 论

病证结合动物模型是在中医学理论指导下，适当结合现代医学理论与实验动物科学知识，分别或同时采用传统中医学病因复制证候动物模型和采用现代医学病因复制疾病动物模型，使动物模型同时具有疾病与证候特征［2］。该模型以疾病模型为基础，具有较好的可靠性及稳定性［4］。目前病证结合模型常用的构建模式是现代医学“疾病”模型复合中医“证候”模型［5-6］。该类模式既注重中医的思路，又注重现代医学对疾病的认识，具有较强的可操作性。故本实验将骨质疏松症模型与肾阳虚模型复合以复制更符合中医临床要求的动物模型。

体内雌激素水平的降低是绝经后骨质疏松症的发生及发展的主要原因，骨代谢发生改变，骨组织形态学及超微结构遭到破坏，最终导致骨生物力学性能下降及骨折发生［7-8］。Saville于1969年首先采用雌鼠双侧卵巢切除诱导骨质疏松模型来模拟该类骨质疏松症，目前该模型已成为标准化的公认的绝经后骨质疏松症经典病理模型。本研究结果示，骨质疏松组及骨质疏松肾阳虚组模型均出现典型的骨质疏松病理学征象：骨小梁排列稀疏，变细，数目减少，间距加宽，可见微骨折等；骨组织形态计量学能进行骨组织和细胞结构的定量分析，为骨结构、骨形成及骨吸收提供客观数据［9］。本结果示，模型小鼠骨小梁平均宽度、骨小梁面积百分率有明显下降，说明骨量和骨的内部结构均都有一定程度的破坏。成骨细胞是骨形成的主要细胞，负责骨基质合成、分泌和矿化，而破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解骨矿质，分泌蛋白酶消化骨基质，促进骨吸收。本结果示，成骨细胞与破骨细胞均增多，表明骨组织处于高代谢状态，即该类骨质疏松为高转换型。骨密度检测能为骨质疏松诊断提供重要的辅助信息，在本研究结果示，去骨质疏松组及骨质疏松肾阳虚组骨密度明显降低。上述数据表明我们利用昆明小鼠去势建立骨质疏松症模型取得成功。

肾阳虚证动物模型是最早建立的中医证候动物模型，自20世纪60年代初，邝安堃教授等首次建立了“氢化考的松肾阳虚”动物模型以来，此后各种“肾阳虚”动物模型相继建立，包括“恐伤肾”性、甲状腺素性、腺嘌呤性、羟基脲性肾阳虚动物模型等［10］，并被用于多种补肾助阳方药药效的研究［11］。利用大剂量肾上腺皮质激素诱导的肾阳虚证动物模型目前最常用，该类动物表现出系列类似肾阳虚症状，如拱背蜷曲、畏寒喜暖、肛温降低、反应迟钝、呼吸深迟、毛发干枯、消瘦、尿液清长等。下丘脑-垂体-靶腺轴的功能改变是肾阳虚的主要病理变化之一［12-14］。有学者利用分子生物学技术RT-PCR化学发光定量法研究肾阳虚大鼠表明其HPA轴受抑，且下丘脑室旁核CRH mRNA的表达量明显比正常对照组减少［15］。垂体在神经内分泌网络系统中具有重要的作用，肾阳虚大鼠垂体ACTH细胞内质网扩张，线粒体空化，ACTH合成分泌受抑［16］，ACTH mRNA表达下调［17］。甲状腺功能生理范围内或病理性降低是肾阳虚的主要病理之一。有研究报道，以醋酸考的松制作的肾阳虚模型，其血中T3、T4浓度和TSH浓度明显降低［18］，且甲状腺滤泡上皮细胞出现内质网、高尔基体扩张、线粒体空化等［19］。本研究结果示，证候模型组与骨质疏松肾阳虚组小鼠血清ACTH、TSH含量均降低，与先前激素性肾阳虚动物模型研究结果类似。同时也证实骨质疏松肾阳虚组小鼠血清ACTH、TSH含量比单纯肾阳虚模型小鼠降得更低，由此我们推测下丘脑-垂体-靶腺轴可能是“骨病及肾”与“肾病及骨”的中间调控通路，通过反馈机制，以使“肾”与“骨”达到相对平衡状态。环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）是细胞功能的重要调节物质，cAMP、cGMP的平衡失调，会引起细胞功能发生明显变化。先前研究表明，cAMP降低、cGMP升高及cAMP/cGMP降低为阳虚，是目前反映阴阳虚较特异的指标之一［10］。本研究结果示，肾阳虚组及骨质疏松肾阳虚组小鼠血浆cAMP及cAMP/cGMP比对照组明显降低，与cAMP降低为阳的阴阳学说相一致。由上述的症状体征结合实验室指标表明复制肾阳虚小鼠模型成功。

综上，通过将去势小鼠骨质疏松模型与氢化可的松小鼠肾阳虚模型有机地结合起来，笔者成功研制了肾阳虚证骨质疏松模型。造模后动物出现了肾阳虚证的特征如畏寒倦卧、精神萎靡、反应迟钝、体质量下降、HPA轴功能紊乱，同时出现了骨质疏松组织病理学改变如骨小梁排列稀疏，变细，微骨折等，成功的建立了骨质疏松肾阳虚模型。

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Study on Osteoporosis Mice Model with Syndrome of Deficiency of Kidney-Yang

CHEN Jianmo，ZHANG Shengjun，XIA Bingjiang. Shaoxing Hospital of TCM，Zhejiang Province，Zhengjiang，Shaoxing 312000，China

Objective：To establish the osteoporosis model with syndrome of deficiency of Kidney-Yang.Methods：Female Kunming mice were randomly divided into control group（group A），syndrome group（group B），disease group（group C），disease with syndrome group（group D）.The model was established by injecting hydrocortisone and resecting bilateral ovaries.Signs and symptoms，level of adrenocorticotropic hormone（ACTH），thyroid stimulating hormone（TSH），cyclic adenosine monophosphate（cAMP），cyclic guanosine phosphate（cGMP），bone density bone，and tissue morphology were observed to evaluate the model.Results：Compared with group A，mice in model group appeared obvious kidney-Yang deficiency symptoms，including hair dry，chill and frail state，low anal temperature.The levels of ACTH and TSH decreased（P＜0.01），and the ratio of cAMP/cGMP decreased（P＜0.01）.Bone density of lumbar vertebra and femur decreased significantly（P＜0.01）.HE staining revealed osteoporosis of mice in group D.Conclusion：The model of osteoporosis with type of deficiency of Kidney-Yang can be established successfully by injecting hydrocortisone and resecting bilateral ovaries.

Osteoporosis；Deficiency of Kidney-Yang；Integration of disease and syndrome；Animal model

R285.5

A

1004-745X（2015）02-0201-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.02.005

2014-11-27）

浙江省中医药科技计划项目（2011ZB153）

△通信作者（电子邮箱：xiabj2006@sina.com）