FIB基因rs6056位点单核苷酸多态性及FIB浓度与糖尿病足的相关性研究

赵静静，王伟灵，周丽霞，杨沁彤，张 莹，赵延荣，邢嘉翌

(1.蚌埠医学院，安徽蚌埠233030;2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院检验科，上海200082;3.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院脉管科，上海200082)

糖尿病足(diabetic foot，DF)是由神经病变、血管病变及感染三者相互作用的结果，而感染是病变加重的重要诱因，约15% ～25%的糖尿病患者会在其一生中发生足部溃疡[1]。大量研究表明血管病变和炎症反应在DF发生、发展中扮演着重要角色[2]。张莹等[3]研究发现纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)作为炎症因子，随着DF溃疡严重程度的加重而逐渐升高，是DF发生的独立危险因素。血浆FIB水平和分子功能的表达主要受遗传和环境等因素的影响，其中遗传是重要的决定因素。大量研究表明FIB β链的合成及其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)在FIB合成过程中起主要调节作用。FIB基因启动子区rs6056 SNP位于4q32 FGB编码区内，与FIB水平的升高具有相关性[4]。目前尚未有该基因SNP与DF相关性的报道。我们探讨了FIB水平及FIB基因rs6056 SNP与DF的关系，为预防DF的发生提供依据。

材料和方法

一、研究对象

随机选择2013年1月至2014年3月在上海市中西医结合医院脉管科住院的DF患者(DF组)123例，男72例，女51例，年龄(70±11)岁;同期内分泌科住院的无足部溃疡的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者(T2DM 组)97例，男55例，女42例，年龄(67±9)岁。筛选同期健康体检者80名作为正常对照组，男46名，女34名，年龄(69±10)岁。糖尿病诊断标准参照美国糖尿病协会2012年发布的《糖尿病诊疗标准(2012版)》[5]。DF的诊断标准参照2011年国际DF工作组(International Working Group，IWGDF)发布的《糖尿病足国际临床指南》[6]。DF的分级参照Wagner分级方法[7]。

二、病例纳入和排除标准

1.纳入标准 (1)符合以上诊断标准;(2)正常对照组选择年龄和性别等与病例组相匹配的，排除高血脂、糖调节异常及临床下肢血管病变者;(3)样本采集过程符合伦理学要求，所有入选者均已签署知情同意书。

2.排除标准 (1)不符合以上纳入标准;(2)近半年内有急性心肌梗死、脑梗死或出血者;(3)合并有严重肝、肾功能不全，心力衰竭，血液病，恶性肿瘤等疾病以及精神病患者;(4)存在其它感染性疾病者。

三、临床资料采集

收集患者的一般临床资料，包括年龄、性别、糖尿病病程及体重指数(body mass index，BMI)等。

四、基因组DNA的提取

抽取入选患者外周静脉血2 mL，严格按照Axy Prep全血基因组DNA试剂盒说明书的操作步骤进行DNA提取。

五、基因多态性检测

应用多重聚合酶链反应-连接酶检测反应法(polymerase chain reaction-ligation detection reaction，PCR-LDR)检测 FIB基因 rs6056(ID:2244)位点的多态性。Taq酶体系购自上海翼和应用生物技术有限公司，上、下游引物由上海瀚宇生物工程有限公司合成。上游引物:5'-ACGAAGCACACGAAGGTTAG-3'，下游引物:5'-CTCAGAACTGGAAAAGCACC-3'。

1.PCR反应体系 总体系为20μL。1×PCR缓冲液2μL，3 mmol/L Mg2+0.6μL，2 mmol/each dNTP 2μL，1 U Taq 酶 0.2μL，ddH2O 12.2μL，0.5 pmol上、下游引物模板各1μL。多重 PCR反应条件:95℃预变性2 min;94 ℃变性90 s，50 ℃退火90 s，65 ℃延伸30 s，循环40次;65℃再延伸10 min终止反应。以上反应在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因扩增仪上进行。反应结束后，取2μL反应产物在3%琼脂糖胶、0.5×TBE中电泳，检测反应的特异性。剩余样本保存于-20℃。

2.PCR产物的连接酶检测反应体系 总体系为10μL。1×PCR 缓冲液 1μL，probe mix(each)1μL，Taq DNA 连接酶0.05μL，ddH2O 4μL，PCR产物4μL。95 ℃变性2 min，94 ℃延伸15 s，50 ℃退火25 s，循环40次。以上反应在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600基因扩增仪上进行。

3.基因测序 取多重PCR-LDR产物1μL，加1μL ABI GS-500 ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，进行电泳，在3730XL DNA Analyzer测序仪(Applied Biosystems/HITACHI，ABI)上进行测序。应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

六、实验室其他指标的检测

FIB采用CAI500全自动血凝仪(日本Sysmex公司)及 Dade Behring公司试剂检测;白细胞(white blood cell，WBC)计数采用 SYSMEX XE-2100全自动血液分析仪及配套试剂检测(日本Sysmex公司);空腹血糖(fasting blood glucose，FPG)、餐后2 h血糖(2 hour postprandial blood glucose，2 hPG)使用Roche公司试剂(葡萄糖氧化酶比色法)，在HITACHI 7600-020全自动生化分析仪(日本日立公司)上测定，糖化血红蛋白(hemoglobin A1C，HbA1C)采用D-10糖化血红蛋白分析仪(Bio-Rad公司)检测，所有操作均严格按照说明书进行。

七、统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。基因型、等位基因频率及Hardy-Weinberg遗传平衡检测采用 SHEsis(http://analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析。如符合Hardy-Weinberg遗传平衡，则表明研究对象是来自同一群体，具有较好的代表性。各组间基因型和等位基因频率比较采用χ2检验，以野生型纯合子CC作为对照，采用非条件Logistic回归计算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval，CI)，用以说明不同基因型和等位基因与DF的发病风险。符合正态分布的数据采用±s表示，3组间比较采用单因素方差分析，方差齐性资料采用LSD检验，方差不齐资料采用Tamhane’s T2(M)检验。计数资料用率或构成比表示，采用χ2检验进行统计推断。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3组间基本资料的比较

DF组WBC和FIB水平明显高于T2DM组和正常对照组(P＜0.05)，DF组病程较T2DM组长(P＜0.05)。3组间年龄及性别构成差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 DF组、T2DM组及正常对照组基线资料的比较 (±s)

表1 DF组、T2DM组及正常对照组基线资料的比较 (±s)

注:与正常对照组比较，*P ＜0.05;与 T2DM 组比较，#P ＜0.05

组别 例数 年龄(岁) 病程(年) FPG(mmol/L) WBC(×109/L) FIB(g/L)DF 组 123 70 ±11 14.72 ±8.32# 8.06 ±3.82* 8.31 ±6.84*# 3.95 ±1.20*#T2DM 组 97 67 ±9 10.11 ±7.73 8.44 ±3.79* 6.38 ±1.65 2.81 ±0.75*正常对照组80 69 ±10 - 5.47 ±0.48 5.83 ±1.53 2.15 ±0.81

二、DF组不同Wagner分级相关指标的比较

根据Wagner分级将DF组分为0～Ⅲ级(57例，男33例、女24例)、Ⅳ级(56例，男33例、女23例)、Ⅴ级(10例，男6例、女4例)。WagnerⅤ级患者WBC和FIB水平均明显高于WagnerⅣ级和Wagner 0～Ⅲ级患者(P均＜0.05);3组间年龄、病程及 BMI差异均无统计学意义(P均 ＞0.05)。见表2。

表2 DF组不同Wagner分级相关指标的比较 (±s)

表2 DF组不同Wagner分级相关指标的比较 (±s)

注:与0～Ⅲ级组比较，*P ＜0.05;与Ⅳ级组比较，#P ＜0.05

Wagner分级 例数 年龄(岁) 病程(年) BMI(kg/m2) WBC(109/L) FIB(g/L)8 ±0.95Ⅳ级组 56 70 ±12 14.50 ±8.26 23.54 ±4.64 8.88 ±9.43* 4.33 ±1.08*Ⅴ级组 10 66 ±12 16.30 ±7.86 21.18 ±3.55 13.56 ±3.90*# 5.63 ±0.36*#0 ～ Ⅲ级组 57 70 ±11 14.63 ±8.59 23.29 ±3.57 6.81 ±1.98 3.2

三、FIB基因rs6056位点基因型及等位基因的判断

1.FIB基因rs6056位点基因型及等位基因频率分布 经Hardy-Weinberg遗传平衡检测，各组样本间rs6056位点基因型及等位基因频率分布均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡(χ2=0.102、0.546、0.595，P ＞0.05)，具有群体代表性。DF 组及T2DM组基因型及等位基因频率分布与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01)。DF组Wagner不同分级间基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P均＞0.05)。见表3、表4及图1。

2.不同基因型间FIB水平比较 DF组TT基因型FIB水平明显高于CC和CT基因型(P＜0.05);T2DM组TT基因型 FIB水平高于CC和CT基因型(P＜0.05)，而CC和CT基因型之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表5。DF患者中Wagner 0～Ⅲ级组TT和CT基因型的FIB水平明显高于CC基因型(P＜0.05)，WagnerⅣ级组TT基因型的FIB水平明显高于CC基因型(P＜0.05)。正常对照组及 DF组 WagnerⅤ级3种基因型间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。 见表6。

表3 DF组、T2DM组及正常对照组FIB基因rs6056位点基因型和等位基因频率分布的比较 [例(%)]

表4 DF组不同Wagner分级FIB基因rs6056位点基因型和等位基因频率分布的比较 [例(%)]

图1 FIB基因rs6056位点3种基因型的波峰图谱

表5 DF组、T2DM组及正常对照组不同基因型之间血浆FIB水平的比较 (±s，g/L)

表5 DF组、T2DM组及正常对照组不同基因型之间血浆FIB水平的比较 (±s，g/L)

注:与CC基因型比较，*P＜0.05;与 CT基因型比较，#P ＜0.05

组别FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型DF 组 3.61 ±1.15 4.16 ±1.17* 4.92 ±0.97*#T2DM 组 2.65 ±0.59 2.87 ±0.80 3.43 ±0.98*#正常对照组2.14 ±0.87 2.15 ±0.58 2.54 ±1.17

表6 DF患者不同Wagner分级3种基因型之间血浆FIB水平的比较 (g/L±s)

表6 DF患者不同Wagner分级3种基因型之间血浆FIB水平的比较 (g/L±s)

注:与CC基因型比较，*P＜0.05

DF患者Wagner分级FIB CC基因型 CT基因型 TT 基因型0 ～ Ⅲ级组 2.99 ±0.79 3.55 ±1.10* 4.07 ±0.53*Ⅳ级组 4.04 ±1.08 4.66 ±0.91 5.29 ±0.73*Ⅴ级组5.63 ±0.30 5.56 ±0.42 5.82 ±0.40

3.单因素Logistic回归分析 采用非条件Logistic回归进行基因型和等位基因频率的相对风险分析，以疾病分类为因变量，危险因素为自变量。结果显示 WBC、FIB、CT基因型和TT基因型、T等位基因为DF的危险因素。见表7。

表7 DF组和正常对照组单因素Logistic回归分析

4.多因素Logistic回归分析 对以上有差异的指标进行多因素Logistic回归分析，在校正了WBC和FIB等混杂因素后，发现TT基因型和T等位基因均不是DF发生的独立危险因素。

讨 论

DF是T2DM最严重的慢性并发症之一，也是糖尿病患者致残、致死的主要原因。FIB既是一种凝血因子，也是一种炎症因子。血液中的FIB水平既可以反映血管病变的炎症过程及内皮功能紊乱，又可以直接参与动脉粥样硬化，是糖尿病血管病变的危险因素。SNP在基因组中的分布相当广泛，SNP碱基位点的改变可导致疾病的易感性，且FIB水平直接受遗传因素的影响。有研究发现FIB编码区的SNP可以导致FIB结构或功能的异常，且与多种疾病相关[8]。因此，探讨炎症因子及其SNP与DF的相关性具有重要意义。

长期的糖脂代谢紊乱损害血管内皮细胞的功能，刺激各种活性物质的释放，导致凝血功能的紊乱和长期炎症反应。本研究结果显示DF组患者FIB水平明显高于T2DM组和正常对照组，DF WagnerⅤ级患者FIB和WBC水平也显著高于WagnerⅣ级和Wagner 0～Ⅲ级患者。朱平等[9]的研究显示，DF溃疡的发生与FIB水平密切相关，FIB每增加1个单位，发生溃疡的相对危险度增加2.51倍，提示FIB可能是DF溃疡的一个独立危险因素。MESA等[10]发现DF溃疡者FIB水平高于DF无足溃疡者，且FIB水平与DF截肢具有相关性，降低FIB水平可以降低DF截肢率。由此可见DF患者体内存在高炎症反应，提示临床治疗中应监测FIB水平，以达到预防的目的。

国外文献报道，FIB基因rs6056 SNP位点突变可以促进FIB水平的升高，且与血栓性疾病有相关性[4]。但有关FIB基因rs6056 SNP与DF的相关性研究目前国内外均未见报道。本研究通过对FIB基因rs6056位点SNP与DF的相关性研究，显示3组间基因型和等位基因频率分布差异均有统计学意义(P均＜0.01)。对基因型和等位基因频率进行Logistic回归分析，发现TT基因型是DF发生的遗传危险因素，以CC基因型携带者患DF的风险定为标准数1，则TT基因型的携带者患DF的风险增加为5.714，提示 FIB基因rs6056位点SNP与DF的发生、发展有关。

本研究观察了FIB基因rs6056位点对血浆FIB水平的影响，发现DF组TT基因型的FIB水平均明显高于CC和CT基因型。FIB基因启动子区rs6056位点SNP的变化可能促进了FIB的转录和表达，进而增加DF的发病风险。这些研究也从基因水平证实了炎症参与了DF的发生，强调炎症在DF发病中的作用，为DF的抗炎治疗提供循证医学依据。本研究进一步显示 DF Wagner分级间基因型和等位基因间差异无统计学意义(P＞0.05)，DF WagnerⅤ级3种基因型间FIB水平差异无统计学意义(P＞0.05)，提示该基因型SNP虽然与DF发病的易感性有关，但与DF病变程度无相关性。可能原因为FIB作为炎症因子，其血浆水平受多种因素的影响，除受自身β链的遗传因素影响外，还受其他基因和/或非基因因素如炎症因子及药物等的影响。

综上所述，通过对FIB基因SNP的研究，为进一步了解FIB基因位点与疾病的相关性奠定基础。由于DF是一种多基因及环境因素联合作用的复杂疾病，本研究的样本量较少，故本研究的结论尚应在大样本中做进一步研究，寻找更多的证据加以验证。

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