CAC1基因在人胃癌细胞和组织中的表达

郑 琪，徐玉乔，张 茜，赵凌宇，廖子君，南克俊(西安交通大学医学院附属陕西省肿瘤医院内一科，西安 7006;第四军医大学附属西京医院病理科;西安交通大学医学院遗传学教研室;西安交通大学第一附属医院肿瘤内科)

世界范围内胃癌的年发病人数在所有恶性肿瘤排第四位，年死亡人数排第二位［1］。全球胃癌的发病率和死亡率在过去几十年中已经出现了明显下降［2］，但它仍然是威胁人类健康和生命最常见的恶性肿瘤之一。晚期转移性胃癌患者的中位生存期仅仅8-10个月，其5年生存率不到7%［3］。研究胃癌相关基因，有助于深入了解胃癌的发病机制，提高其诊断和治疗水平。

泛素-蛋白酶体系统所介导的蛋白质水解，在维持细胞的正常生长和失控增殖的平衡方面起着重要的作用。Cullin家族的泛素连接酶是其中最大的一类RING型E3泛素连接酶，与细胞增殖、分化和凋亡密切相关，cullin活性的失调可能引起细胞的恶性转化和癌变［5，6］。CAC1(CDK-associated cullin 1)是从结直肠癌中分离和鉴定出来的一个cullin家族新基因。它在人体多种正常组织中均有表达，在正常细胞中的表达水平低于肿瘤细胞，在肿瘤细胞中表达水平随着恶性程度的增高而增高。体外实验发现，CAC1与细胞周期G1/S转换的调控有关。而且，它可与细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)结合并提高其活性［7］。由于目前有关CAC1的研究结果主要来源于结直肠癌，因而对它在胃癌中的表达和生物学特性所知甚少。本研究选择与结直肠癌组织学起源类似的胃癌作为研究对象，研究CAC1在胃癌组织和细胞中的表达情况，为进一步研究其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1．1 细胞系与组织标本

人胃黏膜细胞系GES-1购自上海艾研生物科技有限公司;人胃癌细胞系AGS购自中科院上海细胞库;人胃癌细胞系MGC803、BGC823由西安交通大学医学院生物医学研究实验中心保存。

组织标本:选用35例胃腺癌组织(临床分期为Ⅰ-Ⅳ期)及相应正常组织(距癌组织边缘大于10 cm的正常组织)标本，来自西安交通大学第一附属医院，所有样本临床病理资料齐备，病理诊断明确。

1．2 试剂及溶液

10%新生小牛血清购自美国Gibico公司，RPMI 1640培养基购自美国Gibico公司，胰蛋白酶购自中国宝信生物，Trizol购自美国Invitogen公司，逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，cDNA第一链合成试剂盒购自美国Invitogen公司，原位杂交专用盖玻片，多聚赖氨酸(POLY-L-LYSINE)，焦碳酸二乙酯(DEPC)，敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB Kit(20×)购自北京鼎国生物工程有限公司。

1．3 实时定量PCR检测胃癌中CAC1的表达

细胞培养:常规贴壁法将人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系 AGS、MGC803、BGC823 培养于10%小牛血清的RPMI 1640培养基中。取对数生长期的细胞备用。

RNA的提取和逆转录:Trizol法提取培养细胞的总RNA，进行RNA定量分析和RNA电泳，通过逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件:42℃ 15 min;灭活逆转录酶:95℃ 2 min，经过上述反应得到逆转录反应液，可加入RT-PCR反应体系。所得反应液置于-20℃保存备用;分光光度计检测A260/A280值，估计DNA的浓度。

实时定量PCR:依据CAC1的cDNA和管家基因β-actin的cDNA序列，利用Primer Premier 5软件设计实时荧光定量PCR寡核苷酸引物。序列通过BLAST进行比对具有特异性。引物序列由TaKaRa公司设计合成，具体如下。CAC1-forward:5＇-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3＇，CAC1-reverse:5＇-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3＇;β-actin forward:5＇-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3＇，β-actin reverse:5＇-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3＇。实时定量PCR扩增，加样如下，每组设3个重复检测管，各样品混匀后，离心，上机检测，荧光定量PCR仪进行扩增，实时获取扩增曲线;反应过程:95℃预变性5 min→95℃变性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸40 s;总计40个循环。实时荧光定量PCR仪相应软件程序记录、分析检测数据，输出结果。根据公式Folds=2-ΔΔCt计算各检测目的基因的相对表达量，比较各实验组与对照组之间目的基因扩增的变化情况。

公 式:ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)实验组-(Ct目的基因-Ctβ-actin)对照组。

1．4 原位杂交法检测胃癌组织中CAC1的表达

探针的合成:CAC1基因的原位杂交探针序列，依据CAC1编码框序列设计，全长为46 bp，由上海生工生物工程有限公司负责合成。探针序列:5＇-TTC ATT AAG AAC TTG GAG G(U)GGA GGT GTT GAT GTT GAT GGT GGA GC-3＇dig;3＇端地高辛标记，中部2F-RNA修饰“(U)”中碱基。采用多聚赖氨酸对玻片进行处理，癌组织和癌周围正常组织石蜡块各切片5张，每张切片厚度5 μm。

实验步骤:切片脱蜡、暴露核酸片段、预杂交、杂交、杂交后洗涤、滴加封闭液、滴加生物素化鼠抗地高辛、滴加SABC、滴加生物素过氧化物酶、DAB显色、苏木素复染、脱水封片，镜检。结果观察:阳性细胞的胞质着色呈棕黄色。

1．5 统计学分析

所有数据经过整理后输入SPSS19．0软件进行统计分析，实时定量PCR结果使用±s的形式，单向方差分析法(One-way ANOVA)比较不同组间均数的差异，P＜0．05视为差异具有统计学意义;原位杂交实验的临床资料和结果，使用四格表卡方检验法(Chi-square test four-fold table)，P ＜0．05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 CAC1在胃黏膜和胃癌细胞系中的表达

应用实时定量PCR法检测了不同胃癌细胞系和胃黏膜细胞系中CAC1 mRNA表达量，获取目的基因扩增曲线(图 1A)，按照公式:Folds=2-ΔΔCt计算。基因的溶解曲线可反映扩增产物的特异性，如曲线为单峰且峰值高，则表示扩增产物为特异性的靶片段。本研究结果中的溶解曲线均为单峰(图1B、C)，表明获得了特异的扩增产物。

结果显示，无论在胃癌细胞系还是在胃黏膜细胞系中，均可以检测出CAC1 mRNA的表达，但其表达水平有所不同(见图2)。统计学分析显示，胃癌细胞系中，AGS或MGC803细胞系的CAC1 mRNA表达水平均高于 BGC823细胞系(1．000 0±0．000 0 or 0．950 7 ±0．017 6 vs 0．434 0 ±0．041 4，P ＜0．05)，但AGS与MGC803之间CAC1 mRNA表达水平无明显差异(P＞0．05)。另一方面，上述胃癌细胞系(AGS or MGC803 or BGC823)的CAC1 mRNA水平都显著高于胃黏膜细胞系 GES-1(0．201 7 ±0．008 2，P ＜0．05)。

图1 实时定量PCR的CAC1的扩增曲线和溶解曲线Figure 1 Amplification and melt curves of CAC1 by real-time PCR

图2 各细胞系中CAC1-mRNA的表达水平Figure 2 CAC1 mRNA expression in different cell lines

2．2 CAC1在胃癌组织和癌周正常组织中的表达

原位杂交结果显示，CAC1在胃癌组织中表达水平较高，主要表达于肿瘤细胞的胞质，在癌周正常组织中表达水平很低，仅在间质中存在少量非特异性表达(见图3)。统计学分析提示，CAC1在胃癌组织中的阳性表达率明显高于胃癌周围正常组织，两者的差异具有统计学意义;CAC1在癌组织中的阳性表达率与患者年龄、细胞分化程度、淋巴结转移无关，与胃癌的临床分期有关，分期越晚，阳性率越高(见表1)。

图3 CAC1在胃癌组织和胃正常组织中的表达(ISH，×400)Figure 3 CAC1 expression in gastric cancer and normal tissues(ISH，×400)

表1 CAC1在胃癌组织和胃周围正常组织中的表达Table 1 CAC1 expression in gastric cancer and surrounding normal tissues by in situ hybridization

3 讨论

文献报道［7］，对人组织的cDNA文库进行RTPCR法检测，CAC1在结肠、小肠、肝脏、胃、肺、肾、肌肉、心脏、乳腺、脑、脾脏、淋巴结等多种组织中均有不同程度的表达，其中结肠和乳腺组织中的表达水平较高，而在胃组织中仅有微弱的表达;Western blot法发现CAC1在多个正常细胞系和肿瘤细胞系中均有表达，而且CAC1在正常细胞系中的表达水平低于肿瘤细胞，在肿瘤细胞中的表达水平随着恶性程度的增高而增高［7］。

本研究经过实时定量PCR法检测后发现，CAC1的mRNA在胃癌细胞系AGS和MGC803中的表达水平较高，在BGC823细胞系中表达水平相对较低。值得注意的是，3个胃癌细胞系中CAC1的mRNA表达水平均明显高于胃黏膜细胞系GES-1。由此我们推测，CAC1在胃癌细胞中表达水平高于胃正常细胞，可能在胃癌的形成过程中发挥一定作用。

有趣的是，胃癌细胞不同的P53状态可能对CAC1表达无明显影响。本研究所涉及的三个胃癌细胞系中，AGS为P53野生型，MGC803和BGC823均为P53突变型。虽然 AGS和 MGC803细胞的CAC1水平高于BGC823，但前两者之间的CAC1表达水平无明显差异。

此前的研究中检测了66例结直肠癌组织及相应的远端正常结直肠组织中CAC1的表达情况:CAC1主要表达于肿瘤细胞，在间质细胞也有少量表达;正常结直肠组织中CAC1主要表达于黏膜上皮细胞，间质细胞也有少量表达;统计学分析提示，CAC1的表达与结直肠癌的病理类型及临床分期有关，与患者年龄、肿瘤部位及转移等因素无关［7］。

本研究采用原位杂交法，检测了35例胃癌患者的癌组织及相应的胃正常组织中CAC1的mRNA表达情况。结果显示，CAC1在胃癌组织中主要表达于肿瘤细胞的胞质，在相应的胃正常组织中表达水平较癌组织中显著降低。统计学分析发现:CAC1在胃癌组织中的表达高于胃正常组织;CAC1在胃癌组织中的阳性表达率与胃癌的临床分期有关，随着临床分期的升高而增高，而与患者年龄、细胞分化程度、淋巴结转移等因素无关。以上结果与文献报道的结直肠癌组织中CAC1表达特点非常相似。

原位杂交是本研究采用的主要技术之一，它虽与免疫组化技术有许多相似之处，但在组织切片的处理、探针制备、显色方法等方面却有其特殊之处。首先，组织的固定，应尽可能保存组织中的靶核酸成分和原有的组织结构。需要将内源性核酸酶失活，避免其对靶核酸的降解，同时在原位杂交整个过程中避免外源性核酸酶的污染。其次，本实验选用人工合成的单链寡核苷酸探针，特异性较高，分子量小，与相同量的双链DNA探针相比，具有更高的摩尔浓度;用地高辛标记探针后，再用相应的原位杂交检测试剂盒检测与靶分子结合后的地高辛标记。再次，建立合适的杂交条件，注意杂交液及切片变性时的实际温度能否达到所要求的温度，变性后要马上进行杂交反应，不然解链的DNA又会重新复性。最后，原位杂交结果的显示应体现特异性和敏感性。除探针的选择应通过鉴定外，必须在每一次试验中选择阳性或阴性对照。阳性对照可选择Northern/Southern印记杂交或用不同互补探针与靶核酸杂交。阴性对照可选择杂交前用RNA酶或DNA酶消化处理切片。

由于目前难以获得商品化的高度纯化的特异性CAC1抗体，故研究中没有用免疫组化技术去验证原位杂交实验的结果。不过，之前有关结直肠癌的研究中对比了原位杂交法和免疫组化法检测CAC1的表达结果，二者具有良好的一致性［7］。

根据实时定量PCR对不同胃癌细胞系和胃黏膜细胞系中CAC1表达水平的检测，结合组织原位杂交的结果，可以看出，CAC1在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达水平均明显高于相应的胃正常组织和胃黏膜细胞系。因此，我们推测，CAC1对胃癌的某些生物学特性可能有一定影响，其表达升高可能有助于胃癌的形成和发展。

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