碳纳米管/二氧化硅的表面分子印迹聚合物制备及其在芦丁电化学检测方面的应用

唐 婷，汤传贵，曾延波，李 蕾，潘样丹，徐启翔，肖平秀，叶冰青

(嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001)

芦丁(又名芸香碱)作为药物有降低毛细血管通透性和脆性的作用［1］，可保持及恢复毛细血管的正常弹性，常用于高血压脑溢血、视网膜出血、急性出血性肾炎和再发性鼻出血等的辅助治疗。建立快速、方便和准确的测定芦丁含量的方法具有重要意义。芦丁的检测主要采用电化学传感器［2－5］、高效液相色谱［6］、分光光度［7］等方法。电化学方法因灵敏度高、仪器设备简单、成本低等优点常用于芦丁含量的测定。

分子印迹是以目标分子为模板分子，制备具有固定空穴大小、有确定排列功能团的交联聚合物［8－12］的技术。表面分子印迹技术是制备基于载体的印迹聚合物材料，其印迹位点位于材料的表层，可提高目标分子的识别响应速度、降低非特异性吸附，同时易获得一定的物理性质，以解决传统印迹聚合物模板分子去除困难、印迹位点较少和传质速度慢等问题［13－14］。碳纳米管用作分子印迹载体时，在聚合前需进行烯基功能化，其烯基功能化主要采用酰氯化、酰胺化法合成［15－16］，而采用溶胶凝胶法制备烯基碳纳米管的文献报道相对较少。基于芦丁的碳纳米管表面分子印迹聚合物的制备及其电化学传感器研究未见报道。

本文以3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的二氧化硅碳纳米管(MAPS－CNTs/SiO2)为分子印迹载体，芦丁为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用自由基聚合法制备CNTs/SiO2－MIPs，并采用红外光谱、扫描电镜和热重分析等手段对CNTs/SiO2－MIPs进行表征，将CNTs/SiO2－MIPs滴涂至玻碳电极表面构建传感器，采用循环伏安法和差分脉冲伏安法对CNTs/SiO2－MIPs修饰电极的电化学行为进行考察，研究了修饰电极对芦丁的选择性、吸附性，并将CNTs/SiO2－MIPs分子印迹传感器应用于药片中芦丁含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

S－4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)，STA－409PC热重分析仪(德国耐驰仪器制造有限公司)，NEXUS470红外光谱仪(美国Nicolet公司)。CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司);三电极体系:裸玻碳电极(GCE，直径3 mm)或修饰GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

羧基化碳纳米管(CNTs－COOH)(深圳市纳米港有限公司)，芦丁(上海国药集团化学试剂有限公司)，丙烯酰胺、四乙氧基硅烷(TEOS)、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MAPS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、槲皮素、柚皮素、山奈酚、抗坏血酸(阿拉丁试剂有限公司)，复方芦丁片(每片中含有20 mg芦丁)由上海朝晖药业有限公司生产。其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。磷酸盐缓冲液(PBS，0.1 mol/L)由NaH2PO4和Na2HPO4配制而成。

1.2 MAPS－CNTs/SiO2的合成

CNTs/SiO2－MIPs的制备及其用于芦丁的电化学检测如图1所示。取250.0 mg CNTs－COOH、0.5 mL APTES和100.0 mg十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)分散于48.0 mL H2O中，40℃下超声20 min后，搅拌3 h，得溶液A;取5.0 mL TEOS和3.0 mL H2O分散于50.0 mL乙醇中，40℃下超声20 min后，搅拌3 h，得溶液B。将溶液A与B混合，于40℃下超声60 min，再磁力搅拌10 min;用质量分数为25%的氨水调至pH 9.5，磁力搅拌12 h，产物依次用水、乙醇洗涤3次，在65℃下真空干燥12 h后得到二氧化硅包覆的碳纳米管(CNTs/SiO2)。将100.0 mg CNTs/SiO2分散在50.0 mL无水甲苯中，然后加入10.0 mL MAPS，N2保护下120℃回流24 h，产物依次用甲苯、乙醇分别洗涤3次，65℃下真空干燥12 h得到MAPS－CNTs/SiO2。

1.3 CNTs/SiO2－MIPs的合成

在100 mL圆底烧瓶内，将166.1 mg芦丁分散到50.0 mL四氢呋喃中，加入80.0 mg MAPSCNTs/SiO2和71.1 mg丙烯酰胺(AAm)，磁力搅拌30 min进行预聚合反应，再加入942.9 μL EGDMA和20.0 mg AIBN，通入氮气15 min后封好烧瓶口，在65℃油浴下反应24 h，产物用甲醇－乙酸(体积比9∶1)混合溶剂进行索氏提取以除去模板分子，65℃下干燥12 h后制得CNTs/SiO2－MIPs。

除不加模板分子外，采用相同方法制备非印迹聚合物CNTs/SiO2－NIPs。

图1 CNTs/SiO2－MIPs的制备及其对芦丁的电化学检测Fig.1 Preparation for CNTs/SiO2－MIPs and its application in detection of rutin

1.4 修饰电极的制备

玻碳电极依次用0.3，0.05 μm Al2O3粉末抛光处理后，分别用无水乙醇、水超声清洗10 min，备用。20.0 mg CNTs/SiO2－MIPs(或CNTs/SiO2－NIPs)加至1 mL 0.5%的壳聚糖溶液中，超声混合均匀，取该混合溶液5.0 μL涂滴至处理好的裸玻碳电极表面，室温下晾干。将CNTs/SiO2－MIPs/GCE(或CNTs/SiO2－NIPs/GCE)置于含有芦丁的5 mL 0.1 mol/L PBS(pH 4.5)中，搅拌吸附7 min，用水冲洗修饰电极后，将修饰电极置于空白PBS溶液中进行循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)检测。

2 结果与讨论

2.1 CNTs/SiO2－MIPs的表征

2.1.1 红外光谱及热重分析 CNTs/SiO2－MIPs的红外光谱如图2A所示;CNTs－COOH在3 441 cm－1的吸收峰属于羧基的O—H伸缩振动(曲线a);CNTs/SiO2位于428，792，1 083 cm－1处的吸收峰，分别属于Si—O—Si的弯曲振动、对称振动和不对称振动(曲线b);对于MAPS－CNTs/SiO2出现在1 725 cm－1处的峰，属于MAPS上C‖O的伸缩振动峰(曲线c)，说明MAPS成功地接枝到CNTs/SiO2表面;CNTs/SiO2－MIPs的红外图谱中出现了MIPs的1 728，1 251，1 155 cm－1的吸收峰(曲线d)，同时还保留着MAPS－CNTs/SiO2的吸收峰，如428，792，1 083 cm－1，说明CNTs/SiO2－MIPs已成功制备。

图2 不同材料的红外光谱(A)和热重分析曲线(B)Fig.2 FTIR spectra(A)and TGA curves(B)of different materials

热重分析如图2B所示，CNTs－COOH在25～600℃较稳定(曲线a)，只有较小的质量损失，该损失归因于羧基分解;MAPS－CNTs/SiO2损失约为10%(曲线b)，说明SiO2具有较好的热稳定性;但CNTs/SiO2－MIPs的质量损失约为85%(曲线c)，主要来自MIPs的碳骨架分解。热重分析表明MIPs已聚合至MAPS－CNTs/SiO2。

2.1.2 扫描电镜图 CNTs－COOH，MAPS－CNTs/SiO2和CNTs/SiO2－MIPs的扫描电镜如图3所示。CNTs－COOH呈管状(图A)，直径约为35 nm;二氧化硅包覆碳纳米管和MAPS键合后，MAPSCNTs/SiO2管的直径约为145 nm(图B);CNTs/SiO2－MIPs管的直径约为170 nm(图C)，说明碳纳米管表面形成了一层聚合物材料。

图3 材料的扫描电镜图Fig.3 SEM images of different materials

2.2 修饰电极的电化学表征

在 5 mmol/L K3［Fe(CN)6］ 和 0.1 mol/L KCl的混合溶液中，采用循环伏安法对不同材料的修饰电极进行电化学表征(图4)。由图可见，CNTs－COOH/GCE的氧化还原电流响应最大(曲线a)，CNTs－COOH接上MIPs后电流响应略有降低(曲线b)，这可归因于CNTs－COOH的电催化活性好于 MIPs，MIPs相对 CNTs－COOH会阻碍电子传递，所以洗脱模板分子后的CNTs/SiO2－MIPs修饰电极的电流响应降低。由于SiO2的导电性差，MAPS－CNTs/SiO2/GCE的氧化还原峰电流响应降低(曲线c)，CNTs/SiO2－NIPs/GCE的氧化还原峰电流响应比MAPS－CNTs/SiO2/GCE小(曲线d)，这是由于没有空穴位点的非印迹膜覆盖电极表面，阻碍了电极表面的电子传递。印迹电极在未去除模板分子前，由于模板分子的阻碍，［Fe(CN)6］3－/4－的氧化还原反应响应较小(曲线e)，但大于裸玻碳电极的电流响应(曲线f);而去除模板分子芦丁后的CNTs/SiO2－MIPs/GCE由于具有空穴位点的印迹膜覆盖了电极表面，促进了电极表面的电子传递，其氧化还原峰电流响应明显增大(曲线b)，说明表面印迹材料的识别位点可以加快 ［Fe(CN)6］3－/4－在电极表面的扩散，从而促进 ［Fe(CN)6］3－/4－的氧化还原反应。

图4 不同修饰电极的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.3 实验条件的优化

固定芦丁的浓度为50.0 μmol/L，采用DPV法考察吸附时间、PBS吸附液pH值对CNTs/SiO2－MIPs/GCE峰电流响应的影响。结果显示，随着吸附时间增大，分子印迹修饰电极对芦丁的电流响应也增大，3 min时达到最大电流响应的58.3%，7 min时响应电流达到最大，所以选择吸附时间为7 min。当PBS吸附液的pH值在3.0～4.5范围内，响应电流随pH值的增大而增大，当pH值大于4.5时，电流响应反而减小，因此实验选择最佳pH值为4.5。

2.4 传感器的分析特性

2.4.1 修饰电极对芦丁的电化学行为 将CNTs/SiO2－MIPs/GCE和CNTs/SiO2－NIPs/GCE浸入含有50.0 μmol/L芦丁的PBS溶液中，吸附7 min后，在空白PBS溶液中进行CV与DPV检测，以考察分子印迹和非印迹修饰电极对芦丁电流响应的影响(见图5)。结果显示，CNTs/SiO2－MIPs/GCE和CNTs/SiO2－NIPs/GCE对芦丁的电流响应相差约3倍，印迹材料的DPV电流响应是非印迹材料的2.84倍;这归因于CNTs/SiO2－MIPs形成了与模板分子尺寸大小、结构功能相匹配的印迹空穴，从而可对芦丁产生特异性吸附。

图5 不同电极吸附50.0 μmol/L芦丁后的循环伏安图(A)与差分脉冲伏安图(B)Fig.5 Cyclic voltammograms(A)and differential pulse voltammograms(B)of different electrodes after incubating in 50.0 μmol/L rutin solution

2.4.2 传感器的选择性 为了研究CNTs/SiO2－MIPs和CNTs/SiO2－NIPs对芦丁的选择性，考察了CNTs/SiO2－MIPs和CNTs/SiO2－NIPs修饰的电化学传感器对50.0 μmol/L的芦丁、槲皮素、柚皮素、抗坏血酸等类似物的选择性。结果表明，CNTs/SiO2－MIPs修饰电极对芦丁的电流响应分别为槲皮素、柚皮素、抗坏血酸的4.15，5.74，4.88倍，而非印迹电极对芦丁以及类似物的电流响应相差较小。表明CNTs/SiO2－MIPs对芦丁具有较好的选择性，说明CNTs/SiO2－MIPs形成了与芦丁尺寸大小相同、结构功能相匹配的印迹空穴。

2.4.3 线性范围、检出限、重现性及稳定性 在最优条件下，采用DPV法研究了CNTs/SiO2－MIPs/GCE对芦丁的检测性能。如图6所示，随着芦丁浓度的增大，在0.4 V处的峰电流不断增加，其峰电流的大小与芦丁浓度在0.1～100.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为I(μA)=0.016 3+0.007 37c(μmol/L)，相关系数为0.999 2，该方法所得芦丁的检出限(S/N=3)为0.032 μmol/L。将本方法与其它测定芦丁的电化学方法进行对比［17－21］，该方法具有较宽的线性范围和较低的检出限(见表1)。

采用 CNTs/SiO2－MIPs/GCE 对50.0 μmol/L的芦丁连续测定6次，相对标准偏差(RSD)为3.9%。将CNTs/SiO2－MIPs/GCE在4℃存放2周后测定50.0 μmol/L芦丁，响应电流为原始电流的95.2%。表明该电极具有较好的重现性和稳定性。

2.4.4 干扰实验 研究了有机物对5.0 μmol/L芦丁测定的影响。允许干扰量引起峰电流大小的改变在±5%范围内。结果表明，500倍的葡萄糖，75倍的L-脯氨酸、L-胱氨酸，50倍的色氨酸、L-丙氨酸、组氨酸，以及20倍的L-半胱氨酸、山奈酚对芦丁的检测不产生干扰。表明CNTs/SiO2－MIPs/GCE的测定干扰较小，具有较好的选择性。

图6 CNTs/SiO2－MIPs/GCE传感器对芦丁的DPV响应曲线Fig.6 DPV current response curves at CNTs/SiO2－MIPs/GCE with addition of increasing concentration of rutin insert:calibration curve of rutin determination obtained by CNTs/SiO2－MIPs/GCE;concentration of rutin(a－j):0，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，75.0，100.0 μmol/L

表1 本方法与其它测定芦丁的电化学法对比Table 1 Comparison with other electrochemical methods for the determination of rutin

2.5 实际样品的检测

称取1片复方芦丁片(每片含有20 mg芦丁)用研钵研碎，称取20.0 mg粉碎后的芦丁药片，加入3.0 mL乙醇，超声萃取，离心，得上层含芦丁的乙醇液，取20 μL上层乙醇液加入5.0 mL PBS，将CNTs/SiO2－MIPs/GCE在上述溶液中搅拌吸附7 min后，在空白PBS中进行DPV测定，平行5次。测得1片复方芦丁片中芦丁的平均值为19.7 mg，RSD为3.6%。结果表明CNTs/SiO2－MIPs/GCE可用于药片中芦丁含量的测定。

3 结论

本文以MAPS－CNTs/SiO2为分子载体，芦丁为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，EGDMA为交联剂，采用表面分子印迹技术制备CNTs/SiO2－MIPs/GCE电化学传感器。实验结果表明，CNTs/SiO2－MIPs对芦丁具有良好的特异性吸附性能，印迹材料的DPV电流响应是非印迹材料的2.84倍;相对于其它类似的分子(如槲皮素、柚皮素、抗坏血酸)，CNTs/SiO2－MIPs传感器对芦丁具有较好的选择性以及较高的灵敏度，该方法已成功应用于药片中芦丁含量的测定。

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