CLSI方案评价亚硝酸钠氧化法和钒酸盐氧化法检测血清总胆红素

戴 波 杨小彤 韦忠毅

（1.湖南食品药品职业学院，湖南 长沙410208；2.湖南圣湘生物科技有限公司，湖南 长沙410013）

胆红素的测定，传统使用重氮试剂法，该法使用时间较早，测值准确，但其试剂稳定性差、副反应明显。经过多次改良仍然不能消除其比较明显的缺点。化学氧化法包括钒酸盐氧化法、亚硝酸盐氧化法、过硫酸盐氧化法及综合氧化法等，化学氧化法因其具有抗干扰能力强、线性范围宽、重复性好及准确度高[1]等优点现在是最流行的测定血清胆红素的方法。目前市场主要使用钒酸盐氧化法和亚硝酸盐氧化法，且两方法使用的原料差别不大，试剂性能也相近，本实验参考CLSI的部分评价方法，主要通过精密度，线性范围，抗干扰性能三方面比较两试剂的区别，方便实验室或医院根据不同的需要选择。

1 材料

1.1 试剂和仪器

仪器使用日立7080全自动生化仪，试剂使用北京利德曼生化股份有限公司生产的总胆红素测定试剂盒（钒酸盐法）以及上海荣盛生物药业有限公司生产的总胆红素测定试剂盒（亚硝酸盐法）。

1.2 标准液与质控液

标液使用朗道定标血清2350-794，质控液使用朗道质控血清1530-791，1532-616。

1.3 样本

选用当天新鲜血清，无溶血，脂血（黄疸样本可作为高值样本）。

1.4 干扰物

抗坏血酸干扰物：100g/L的抗坏血酸注射液用生理盐水稀释到10g/L。肝素干扰物：使用12500U/支的肝素抗凝剂。枸橼酸钠干扰物：使用3.2%枸橼酸钠抗凝剂。血红蛋白干扰物：为外购干扰试剂。

1.5 数据分析

使用IBM SPSSStatistics 19数据分析软件进行统计分析。

2 实验方法

2.1 精密度测试

参考CLSI EP5[2]文件要求：取高值和低值的血清样本各一份，用两总胆红素试剂测试高低值样本各20次，计算批内精密度。取高值和低值血清各一份，分装为20份于-20℃左右避光保存。每天取高低值各一份用两试剂各进行一次测试，连续测试20天，测定批间精密度。

2.2 线性评价

参考CLSI EP6[3]文件要求：根据两试剂的线性范围，钒酸盐氧化法（0-684μmol/L），亚硝酸盐氧化法（0-427μmol/L），取能覆盖其线性范围的高值样本（H）与生理盐水为低值样本（L），按H：L为1：19,1：9,1：4，2：3,4：1，的比例配制5个浓度的样本，与H一起组成6个浓度不等间距排列的样本。每个浓度水平进行两次重复测试。对结果进行线性分析。

2.3 抗干扰评价

参考CLSI EP7[4]文件要求：先进行干扰筛选，计算出两试剂对个干扰物的点估计值（dobs）和临界值（dc），进行比较选出有干扰效应的干扰物。后进行测试剂量效应，精确干扰物浓度的影响。

3 实验结果

3.1 精密度

精密度CV值结果详情见表1：高值（192.5μmol/L）,低值（23.4μmol/L），两试剂测试精密度结果良好，亚硝酸盐氧化法试剂在低值测试上稍优于钒酸盐氧化法试剂。

表1 高低值精密度测试结果

3.2 线性范围

钒酸盐氧化法在（0-700μmol/L）范围时，线性良好，Y=0.979X-6.001，r=0.99995。亚硝酸盐氧化法在（0-500μmol/L）范围时，线性较好，Y=0.943X-1.024，r=0.99927，但对接近500的值测试结果已经不太理想。

图1 钒酸盐氧化法线性关系

图2 亚硝酸盐氧化法线性关系

3.3 抗干扰

对肝素，抗坏血酸，枸橼酸钠，血红蛋白等干扰物进行筛选，比较结果后得枸橼酸钠对两胆红素试剂无干扰效应。肝素对两试剂呈现为正干扰。抗坏血酸，及血红蛋白对试剂均有不同程度的负干扰。再使用肝素、抗坏血酸、血红蛋白等烦扰无进行剂量实验，得出结果如表2，表2表明了这三种干扰物对两种胆红素试剂测定结果的影响。

表2 干扰实验结果

4 结论

胆红素氧化法的原理是在pH=3的条件下，血清胆红素可以经钒酸盐氧化成胆绿素。从而使胆红素特有的黄色减少，可根据其吸光度下降的差值来计算出胆红素浓度。亚硝酸盐氧化法的原理是在适合的缓冲液中加入特定的加速剂，使血清胆红素被反应介质中新生成的亚硝酸氧化成淡绿色化合物，引起胆红素吸光度下降。精密度测试结果中，亚硝酸盐氧化法对低值的测试比钒酸盐氧化法较好，但在测试高值的时候就没有这些差别了，可能是因为钒酸盐自带的淡黄色的照成试剂空白吸光度稍大于实际值。其影响在可接受范围内，精密度CV值均在5%以内，准确度偏差也在范围内。钒酸盐氧化法试剂在（0-700μmol/L）范围内结果良好。亚硝酸在（0-500μmol/L）范围内结果也可接受，但对更高的值进行测试时已经偏差较大，不推荐使用。因此在测定范围上，钒酸盐氧化法试剂要明显优于亚硝酸氧化法试剂。两试剂的干扰筛选结果是一致的，肝素对两试剂干扰效应也一致。但是抗坏血酸与血红蛋白对亚硝酸盐氧化法试剂的干扰效应要比对钒酸盐氧化法试剂的强。由于条件限制，不能使用更多的干扰物进行实验，但总体来说，钒酸盐氧化法试剂的抗干扰能力要大于亚硝酸氧化法试剂。

［1］曾东良.钒酸盐氧化法与干化学法测定总胆红素的方法学比较[J].华夏医学,2005,18(1)：33-35.

［2］Daniel W.T.,Anders K,John W.K.,et al..Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods[S].NCCLSDocument EP5-A2,2004,24(25)：8-14.

［3］Daniel W.T.,Martin K.,J.Rex A.,et al..Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods[S].NCCLSDocument EP6-A,2003,23(16)：10-16.

［4］Donald M.P.,James C.B.,Melvin R.G.,et al..Interference Testing in clinical Chemistry[S].NCCLSDocument EP7-A,2002,22(27)：25-30.