虎奶菇菌核多糖的化学修饰及活性研究

刘阿娟，张 静，张化朋，张 鹏，梁 涛

（陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062）

虎奶菇，又称菌核侧耳或地核侧（Pleurotustuber-regium）、虎奶菌、核耳菇、茯苓侧耳、南洋茯苓等，为担子菌纲口蘑科侧耳属真菌，是一种珍稀食药用真菌，性甘温，具有补气益血、治气血虚弱的作用［1］；主要分布在我国云南省的腾冲和章凤地区，以及马来西亚、澳大利亚、印度尼西亚等国家.虎奶菇菌核中除多种氨基酸、挥发油等具有较强的生物活性外［2］，多糖也具有重要的生物活性，如抗氧化、降血糖、抗肿瘤及细胞的凝集等作用［3－5］.多糖的生物活性直接或间接地受其分子结构的影响，对多糖分子结构进行修饰，可以提高或赋予多糖活性，降低其毒副作用［6－12］.本文报道对虎奶菇菌核多糖进行化学修饰，并对其修饰前后的体外抗氧化活性及对α－葡萄糖苷酶和α－淀粉酶的抑制率进行研究，以期为虎奶菇菌核多糖药物及功能性食品开发提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虎奶菇菌核多糖由陕西师范大学食品工程与营养科学学院化学分析实验室制备，P-硝基苯－α－吡喃葡萄糖苷为Sigma公司产品，其他化学试剂均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

真空冷冻干燥机（德国Christ公司）；U-3010紫外分光光度计（日本日立公司）；HH-SA型恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-S4型电热恒温水浴锅（北京科伟永型仪器有限公司）；不锈钢超声水浴加热提取器（上海宁商超声仪器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 虎奶菇菌核多糖的提取 虎奶菇菌核粉碎、过60目筛，50℃烘干，95%乙醇脱脂，再置于50℃烘箱中烘干去除残留的乙醇，冷却至室温得到干燥的脱脂虎奶菇菌核粉.将其与蒸馏水以1∶30的固液比混合，在100℃下浸提2h，浸提2次，离心取上清液，透析，冷冻干燥得到棕色虎奶菇菌核粗多糖HNP.

1.3.2 虎奶菇菌核多糖的衍生化制备 硫酸酯化虎奶菇菌核多糖（S-HNP）的制备参考文献［13-14］；乙酰化虎奶菇菌核多糖（A-HNP）的制备参考文献［15］；磷酸化虎奶菇菌核多糖（P-HNP）的制备参考文献［16-17］；羧甲基化虎奶菇菌核多糖（C-HNP）的制备参考文献［18］.

1.3.3 虎奶菇菌核多糖的活性研究 羟自由基（·OH）清除率测定参考文献［19-20］；总还原能力的测定参考文献［21］；DPPH·清除率测定参考文献［22］；超氧阴离子自由基的清除作用测定参考文献［21］；α－淀粉酶的抑制率测定和α－葡萄糖苷酶的抑制活性测定参考文献［23-24］.

2 结果与讨论

2.1 虎奶菇菌核多糖及其衍生物对·OH的清除作用

·OH清除率是抗氧化作用的重要指标［25］.在试验浓度范围内，化学修饰前后的5种虎奶菇菌核多糖对·OH自由基的清除率随着浓度的增加而增大（图1），其清除作用在修饰前后发生明显变化，尤其是当多糖浓度超过500μg/mL后，磷酸化修饰和乙酰化修饰后的虎奶菇菌核多糖对·OH自由基的清除率明显小于未修饰的多糖，而羧甲基化及硫酸化修饰均比未修饰的显著提高，且羧甲基化作用后多糖的清除率最大，可能是羧甲基化加强了多糖分子对自由基反应的链终止作用.5种虎奶菇菌核多糖对·OH的清除率依次为:羧甲基化＞硫酸化＞未修饰＞磷酸化＞乙酰化.

图1 虎奶菇菌核多糖对·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effects of polysaccharide from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regiumon·OH

2.2 虎奶菇菌核多糖及其衍生物总还原力的测定

还原力的大小在一定程度上反映其抗氧化功能的强弱，因此，可通过测定还原力来说明抗氧化活性的强弱［26］.在试验浓度范围内，化学修饰前后的5种虎奶菇菌核多糖的还原力随着浓度的增加而增大（图2）.磷酸化修饰和乙酰化作用后的虎奶菇菌核多糖的总还原力明显低于未修饰多糖，而羧甲基化及硫酸化的修饰均显著提高其还原能力，且羧甲基化作用后多糖的还原力最大.5种虎奶菇菌核多糖总还原力依次为:羧甲基化＞硫酸化＞未修饰粗品＞磷酸化＞乙酰化.

图2 虎奶菇菌核多糖的总还原力Fig.2 Reducing power of polysaccharides from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regium

2.3 虎奶菇菌核多糖及其衍生物对DPPH·的清除作用

在试验浓度范围内，随着多糖浓度的增大，化学修饰前后的5种虎奶菇菌核多糖对DPPH·的清除率均增大（图3），在较低的供试浓度范围内，DPPH·清除率与多糖度几乎成正比，而在较高供试浓度范围内，其随浓度增加的增幅相对减小，修饰的虎奶菇菌核多糖对DPPH·的清除作用均比未修饰的强，清除率依次为:羧甲基化＞硫酸化＞磷酸化＞乙酰化＞未修饰粗品.

图3 虎奶菇菌核多糖对DPPH·的清除作用Fig.3 Scavenging effects of polysaccharide from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regiumon DPPH·

2.4 虎奶菇菌核多糖及其衍生物对超氧阴离子自由基的清除作用

在试验浓度范围内，随着多糖浓度的增大，化学修饰前后的5种虎奶菇菌核多糖对O2－·的清除率均增大（图4），其在较低供试浓度范围内的增幅小于其在较高浓度范围内的增幅.在相同浓度下虎奶菇菌核多糖修饰后对O2－·的清除率均比未修饰的高，5种虎奶菇菌核多糖对 O2－·的清除率依次为:羧甲基化＞硫酸化＞磷酸化＞乙酰化＞未修饰粗品.

图4 虎奶菇菌核多糖对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of polysaccharide from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regiumon O2－·

2.5 虎奶菇菌核多糖对α－淀粉酶的抑制作用

在试验浓度范围内，修饰前后的虎奶菇菌核多糖对α－淀粉酶的抑制率（图5）依次为:羧甲基化＞硫酸化＞乙酰化＞磷酸化＞未修饰粗品，5种多糖对α－淀粉酶均有一定的抑制作用，抑制率呈剂量依赖性.但相同浓度下，修饰后的抑制率显著高于未修饰的抑制率，且经羧甲基化修饰后其抑制率是未修饰的两倍，与阳性对照阿卡波糖的抑制率相差不多，说明经修饰后的虎奶菇菌核多糖，尤其是羧甲基化和硫酸化修饰的虎奶菇菌核多糖，有可能作为降血糖的酶抑制剂药物而应用于临床实践.

图5 虎奶菇菌核多糖对α－淀粉酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of polysaccharide from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regiumonα-amylase

2.6 虎奶菇菌核多糖对α－葡萄糖苷酶的抑制作用

α－葡萄糖苷酶抑制剂可抑制葡萄糖苷酶的活性，使葡萄糖的生成和吸收减缓，从而降低餐后高血糖.图6显示，在试验浓度范围，修饰前后的5种虎奶菇菌核多糖对α－葡萄糖苷酶抑制程度随浓度的增大而增大，其抑制活性依次为:羧甲基化＞硫酸化＞磷酸化＞乙酰化＞未修饰粗品.羧甲基化修饰显著提高了对α－葡萄糖苷酶抑制活性，但略低于同浓度下阳性对照阿卡波糖，说明羧甲基化和硫酸化修饰的虎奶菇菌核多糖对α－葡萄糖苷酶有很强的抑制活性，有可能用于控制和治疗糖尿病.

图6 虎奶菇菌核多糖对α－葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of polysaccharide from the mushroom sclerotia of Pleurotus tuber-regiumonα－glycosidase

3 结论

羧甲基化和硫酸化的修饰均显著提高虎奶菇菌核多糖的总还原力，羧甲基化对DPPH·、O2－·和·OH的清除率提高的尤为显著，说明羧甲基化和硫酸化虎奶菇菌核多糖可作为抗氧化剂进行开发利用.化学修饰后的虎奶菇菌核多糖均明显增强对α－淀粉酶和α－葡萄糖苷酶的抑制作用，其中羧甲基化修饰和硫酸化修饰的抑制率增幅最大，说明羧甲基化和硫酸化修饰的虎奶菇菌核多糖有可能用于控制和治疗糖尿病.羧甲基化和硫酸化的虎奶菇菌核多糖有开发为功能性食品和保健药品的潜质.

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