粪便DNA 中MGMT、XAF1 基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌筛查中的应用研究

乐有林，赵己未，孙 嫣，郭升超，聂玉强，曾 晖

1. 广州医学院第三附属医院消化内科，广东 广州510150； 2. 广州市第一人民医院； 3. 广州医学院荔湾医院

结直肠癌的发生、发展是一个多因素、多基因、多步骤改变的过程，它所涉及的分子生物学基础主要包括染色体不稳定性、微卫星不稳定及CpG 岛甲基化。已有研究显示结直肠癌组织中XAF1、MGMT 基因启动子存在高甲基化［1-2］。Petko 等［3］对粪便DNA 基因甲基化状况进行多基因联合检测，结果显示组织与粪便中DNA 甲基化未见明显差别;同时与没有进行筛查对照组相比，大肠癌发生率可减少35%，死亡率可减少54%，提示在粪便中检测DNA 的甲基化用来筛查结直肠癌是一种可行的方法。目前欧美等国的结直肠癌筛查指南已将粪便DNA 检测纳入其中，但是寻找高敏感性肿瘤标志物及降低其相关检查费用成为关键［4］。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2011 年9 月-2012 年10月广州医学院第三附属医院住院需进行肠镜检查的患者132 例，其中结直肠腺癌40 例(肠镜活检病理示腺癌)、腺瘤性息肉(肠镜病理示腺瘤性息肉)40 例、正常对照住院患者(肠镜示所见结直肠黏膜未见明显病变)52 例;男65 例，女67 例，年龄38 ～88 岁，平均年龄(49 ±3.13)岁。所有患者入院常规检查大便潜血(免疫胶体金法)及CEA(化学发光法)，大便潜血阳性包括阳性与弱阳性;CEA 阳性为＞5 μg/L。肠镜镜检前服用泻药(硫酸镁或者复方聚乙二醇)，排便时按医生指导使用粪便标本盒留取粪便并告知医生，医生在2 h 内用电子天平随机取200 mg 粪便放入冻存管并放入液氮罐冻存，1 周内用QIAamp DNA Stool Mini Kit 按程序3 提取粪便肠道细胞DNA，所有患者均知情并签署知情同意书。

1.2 试剂及仪器 (1)QIAamp DNA Stool Mini Kit HotStaTaq Plus Master Mix Kit(德国Qiagen 公司)、ZymoTaq premixTM(美国ZYMO 公司)，50 bp ladder MARK(东盛)，CpGenomeTMDNA Modification kit(美国Chemicon 公司)，pH 校正液，引物合成(Invitrogen 上海贸易有限公司)、分光光度计(NanoDrop ND1000，美国NanoDrop)，PCR 仪、UVI-紫外分析仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad 公司)，电泳系统、水浴箱、液氮罐、涡旋振荡器、移液器(eppondorf)、电子天平、pH 计等。

1.3 自粪便中抽提人基因组DNA 并验证存在人体DNA 依据QIAGEN 公司QIAamp DNA Stool Mini Kit说明书程序3 提取人体DNA，最后洗脱过柱体积为80 μl。采用NanoDrop ND1000 分光光度计测量浓度。扩增人XAF1 基因，检测抽提DNA 是否含人体genomic DNA。引物L:AGATCTCCTCCCTCCCTGAA(-107);R:GTCTCCAGCTGCTTGTCCTC(+ 164);PCR 体系:HotStarTaq Plus Master Mix 20 μl，DD water 13 μl(含BSA 0.3 μg/μl)，coralord concentrate 4 μl，上下游引物各1 μl(0.1 μl/L)，模板1 μl。PCR 反应体系:热启动95 ℃5 min;解链94 ℃30 s，退火57 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，35 个循环;最后72 ℃延伸10 min。取8 μl 反应体系在2%琼脂糖凝胶110 mA 电泳35 min，采用凝胶成像系统电泳结果并保存图像;扩增成功标本进行下一步甲基化修饰。

1.4 亚硫酸盐修饰 取成功扩增XAF1 标本的DNA(1.8 ～2.0 μg)，严格按CpGenomeTMDNA Modification kit 说明书进行操作，在步骤四中所有标本均50 ℃避光孵育15 h，然后-70 ℃保存备用。

1.5 特异性PCR 所用基因甲基化引物序列及退火温度见表1，PCR 体系:Mix 25 μl，DD H2O 18 μl，引物1 μl(0.5 μl/L)，模板5 μl。PCR 反应体系:热启动95 ℃10 min;解链95 ℃30 s，退火45 s，延伸72 ℃45 s，40个循环;最后72 ℃延伸7 min。取8 μl 反应体系在2%琼脂糖凝胶150 mA 电泳50 min，采用凝胶成像系统电泳结果并保存图像。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0 统计软件，采用χ2检验进行显著性检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 XAF1、MGMT 基因启动子甲基化引物序列及退火温度Tab 1 Primers and annealing temperature of XAF1 and MGMT gene promoter methylation

2 结果

2.1 提取粪便基因组DNA 自粪便中提取人基因组DNA 检测132 份粪便标本，实现XAF1 扩增122 例(见图1)，经分光光度计测量DNA 含量1.8 ～48 μg。

2.2 MSP 检查结果 MGMT 结直肠正常组与腺瘤组阳性率比较，差异有统计学意义(P ＜0.05);MGMT 结直肠结直肠癌组与腺瘤组阳性率比较，差异无统计学意义(P ＞0.05);XAF1 结直肠正常组与腺瘤组阳性率比较，差异有统计学意义(P ＜0.05);XAF1 结直肠结直肠癌组与腺瘤组阳性率比较，差异无统计学意义(P＞0.05);使用XAF1 及MGMT 联合检测对结直肠癌检出率比单用一种要高，但差异无统计学意义(P ＞0.05，见图2、表2)。

2.3 MSP 结果与粪便潜血及CEA 结果比较 MSP方法对结直肠癌检测的阳性率比粪便隐血试验高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。MSP 方法对结直肠癌检测的阳性率比血清CEA 高，差异有统计学意义(P ＜0.05，见表3)。

图1 从粪便中提取人体DNA 并扩增XAF1 基因Fig 1 Extraction of DNA from human feces and amplification of human XAF1 gene

图2 结直肠癌患者粪便标本中XAF1 基因和MGMT 基因甲基化检测结果电泳图Fig 2 The lectrophoresis of XAF1 and MGMT gene methylation detection results of colorectal cancer specimens

表2 MGMT 基因、XAF1 基因启动子甲基化阳性率［例数(%)］Tab 2 The positive rates of MGMT gene，and XAF1 gene promoter methylation［n(%)］

表3 MSP 方法检测XAF1 基因和MGMT 基因甲基化率与粪便潜血及CEA 检测结果比较［例数(%)］Tab 3 Comparison of MSP method for detection of XAF1 gene and MGMT gene methylation rate and fecal occult blood and CEA［n(%)］

3 讨论

近年来，随着我国的环境和膳食结构的改变以及人口的老龄化，结直肠癌发病率和死亡率逐年上升，发病年龄也提前，相关医疗费用也大幅度上升［5］。尽管新型化疗药物、生物疗法和各种综合治疗的出现和改进，患者的生存率有较大改善，但是晚期5 年生存率仍不足10%，而Dukes A 期5 年生存率可达80%，所以结直肠癌治疗的关键在于早发现，从而有根治的机会。利用MSP 的方法检测粪便DNA 甲基化来筛查结直肠癌操作简便、安全、敏感性高，患者依从性好。Zhang等［6］对大肠癌患者中DNA vimentin、OMSR、TFPI2 的甲基化阳性率分别为53.3%、68.3%和75.0%，三者联合检测对结直肠癌和结直肠腺瘤敏感性分别为86.7%和76.5%。

MGMT 是一种DNA 修复酶，其编码产物MGMT可将烷化剂在O6位形成的O6-鸟嘌呤化合物从DNA上移除，使DNA 受到损伤的细胞不再增殖，从而阻止肿瘤的发生。有研究显示MGMT 基因启动子高甲基化导致MGMT 蛋白表达减少可能是导致肿瘤发生、发展的重要原因［7］。消化系统是直接接触亚硝基化合物等烷化致癌物的场所，因此，MGMT 基因启动子高甲基化导致的MGMT 表达缺失在消化道肿瘤的形成中具有非常重要的意义。

XAF1 是近年发现的一个新的肿瘤抑制因子，位置在17p132 上，与P53 毗邻。其广泛存在于正常人体组织中，在大多数恶性肿瘤组织细胞中低表达或者表达缺失［8］。XAF1 通过直接结合并抑制XIAP 对caspase 3 的抑制作用和通过增加P53 翻译后修饰发挥诱导肿瘤凋亡作用，而XAF1 的表达抑制与基因启动子区CpG 岛的高甲基化状态有关［9-10］。

本实验使用试剂盒提取粪便DNA，特异性甲基化PCR 检测甲基化状态。方法简单、价格低廉、安全、患者依从性好，无需特殊及昂贵试剂及仪器，且每个标本只需100 元左右，患者依从性好，适用于大规模筛查。本实验收集粪便132 例，最终PCR 证明存在人体肠道脱离细胞DNA 122 例，成功提取率92.4%;10 个标本PCR 无目的基因可能是由于一些腹泻患者粪便本身就不含脱落细胞或者本身含量太少或提取的DNA 中一些杂质(如多聚糖、胆色、素胆汁酸、胆盐)抑制PCR反应。本实验数据显示MGMT 在结直肠癌中的阳性率为50.0%;在腺瘤性息肉中的阳性率为42.1%，比其他文献报道低，可能原因有:(1)标本量少(0.2 g);(2)在提取过程DNA 丢失;(3)在使用CpGenomeTM DNA Modification kit 试剂盒进行亚硫酸盐修饰时，还需在pH 为5、温度为55 ℃的水浴15 h，造成大量DNA降解［11］，导致大量肿瘤DNA 丢失，最后PCR 无法将其测出，这也可能是使用试剂盒目前存在的最大问题。在实际筛查中，我们可以通过以下手段进行改善:择期取固体粪便从其表面多处刮取获得富含细胞而杂质较少的部分粪便标本，再进行DNA 提取筛查;配制洗脱液洗脱粪便表面细胞并离心;重复多次取样;因为粪便成分复杂，含较多可降解DNA 物质且脱离细胞一般附在粪便表面，所以取新鲜粪便，马上提取其DNA，以免DNA 降解。通过以上方法也可提高肿瘤DNA 含量。

从实验结果来看，在腺瘤与结直肠癌患者中，粪便DNA 甲基化检查敏感性比潜血和CEA 敏感性明显要高，但MGMT、XAF1 基因甲基化在腺瘤与腺癌的阳性率无明显差异，这些都提示粪便DNA 甲基化检测可以更早地发现肠道病变，对及早发现腺瘤并切除癌变前病变、降低结直肠癌的发病率及死亡率有很大的意义，这也可能是甲基化本身在结直肠肿瘤变化中就是早期事件的缘故。在正常组织中XAF1、MGMT 基因的甲基化阳性率也达到40%，这可能与标本污染、结肠镜检的假阴性率或者高甲基化癌前隐窝等因素有关。

随着分子生物学及其技术的发展，结直肠癌分子机制的进一步阐清，根据不同基因在腺瘤-癌序列中不同时期的作用，我们可以利用每个基因在此序列中的特点，联合多基因检测，对结直肠癌的诊断做出综合判断。继续优化DNA 提取及亚硫酸盐修饰试剂及程序，尽量减少实验过程DNA 的损失，同时使用灵敏度更高的TAQ 酶以提高甲基化检出率。

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