伯乐树SSR-PCR反应体系的优化

闫丽君，王红霞 ，黄芳芳，何长青，梁 艳，徐刚标

（1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.国家林业局林产工业规划设计院，北京 100010）

伯乐树SSR-PCR反应体系的优化

闫丽君1，王红霞2，黄芳芳1，何长青1，梁 艳1，徐刚标1

（1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.国家林业局林产工业规划设计院，北京 100010）

以伯乐树叶片为材料，利用单因素试验及正交试验对影响伯乐树SSR-PCR扩增的主要因素进行了优化。结果表明，伯乐树SSR-PCR最佳反应体系（20 µL）为：Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，引物0.3 µmol/L，DNA 90 ng。这为利用SSR标记进一步开展伯乐树种群遗传多样性研究奠定了前期实验基础。

伯乐树；SSR-PCR；体系优化

伯乐树Bretschneidera sinensis Hemsl.为伯乐树科伯乐树属落叶乔木，是我国特有的单科、单属、单种孑遗植物[1]，零星间断分布于我国长江流域以南各省区[2-3]。伯乐树自然更新困难[4]，人为干扰严重，现已处于濒危状态，已被列为国家一级重点保护植物[5]。

简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），又称微卫星DNA，是一类由几个（多为1-6个）碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，长度较短，200 bp左右，广泛分布于基因组的不同位置[6]。与其它的分子标记相比，SSR标记为共显性标记，具有分布广、多态性丰富、重复性好、可靠性高的独特优点，已被广泛应用于植物遗传连锁图谱构建、种质资源鉴定及遗传多样性分析[7]。

本研究拟采用单因素与正交试验相结合方法，对影响伯乐树SSR-PCR扩增的主要因素进行优化，旨在建立一套适合于伯乐树种群遗传多样性分析的SSR-PCR反应扩增体系。

1 方法与材料

1.1 材料

伯乐树叶片采自湖南阳明山国家级自然保护区。野外采集的叶片经硅胶干燥后，置于-70℃冰箱保存备用。SSR-PCR反应引物参考文献[8]，由华大基因公司合成。根据预试验结果，选用引物Bl9（F: ACACACACACACAGAGAGAGAG；R:CAACCAAGGAAGCCATTACAAC）作为PCR扩增体系优化试验的固定引物。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取与检测

伯乐树总DNA提取，参考文献[9]，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，Eppendorf公司Bio Photometer核酸蛋白质分析仪测定浓度与纯度。提取的DNA稀释至60ng/µL，-20℃保存备用。

1.2.2 单因素试验设计

对影响SSR-PCR反应主要因素（Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA）进行单因素优化试验（表1）。当一种因素进行浓度（用量）梯度变化实验时，其它因素的浓度不变，比较不同浓度处理对SSR-PCR扩增结果的影响。

表1 SSR-PCR单因素试验设计Table1 Single factor experiments design for SSR-PCR

1.2.3 正交试验设计

根据单因素试验确定的各影响因素的浓度范围，设计5因素3水平正交试验设计（表2），以确定适合伯乐树SSR-PCR扩增的最佳反应体系。

表2 SSR-PCR正交试验设计Table2 Orthogonal design for SSR-PCR

1.2.4 退火温度确定

在试验确定的最佳反应体系基础上，设置6个退火温度梯度（53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃）试验，以确定选用引物的最佳退火温度。

1.2.5 扩增产物检测

取扩增产物5 µl与等量上样缓冲液（98%去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青）混匀，于95℃变性5 min后，置冰上冷却后，取3 µL上样，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，150 V恒压。当溴酚蓝指示剂距底部1 cm时，停止电泳，银染[10]，用CanoScan LiDE 100型扫描仪扫描保存。

1.2.6 最佳反应体系验证

用优化的伯乐树SSR-PCR最佳反应体系对样本进行PCR扩增，验证其稳定性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

影响SSR-PCR反应5种主要因素6个不同浓度水平的扩增结果图1。由图1可知，Mg2+浓度梯度对SSR-PCR扩增产物影响显，随着Mg2+浓度增大，条带亮度由暗变亮再变暗。Mg2+浓度为0.625 mmol/L时，扩增条带不明显；浓度范围为1.25～2.5 mol/L，条带清晰明亮；浓度范围为3.125～3.75 mmol/L，条带模糊。6种dNTP浓度均可扩增出产物，但浓度不同，扩增条带的亮度差异明显。低浓度或高浓度条件下，扩增条带不清晰、模糊，当浓度为0.15 mmol/L时，条带最为清晰。不同引物浓度的扩增结果差异较小，引物浓度较低（0.1 µmol/L）时，扩增条带不清晰；引物浓度达0.2 µmol/L时，扩增条带的亮度不随引物浓度变化而变化。Taq DNA聚合酶为0.5 U时，扩增条带最为清晰；Taq DNA聚合酶用量大于0.5 U时，扩增条带有弥散现象出现。模板DNA用量对SSR-PCR扩增影响不明显，模板DNA用量为75 ng时，条带最清晰。

2.2 正交试验

正交试验结果见图2。由图2可知，第11组条带清晰明亮，稳定性好：由此确定伯乐树SSRPCR扩增最佳反应体系为。20 µL反应体系含有Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，引物0.3 µmol/L，DNA 90 ng。

2.3 退火温度

不同退火温度对SSR-PCR扩增影响结果（图3）表明，退火温度范围为53～55℃，电泳条带亮度相当；退火温度高于55℃时，PCR扩增的条带亮度减弱。因此，综合考虑选择55℃作为引物Bl9的最适退火温度。

2.4 最佳反应体系验证

利用最佳反应体系，对19份伯乐树样品进行SSR-PCR扩增的结果（图4）显示，所有样品扩增出的目的条带明亮清晰。这说明本研究筛选出的最佳反应体系扩增稳定，可用于进一步开展伯乐树SSR遗传多样性研究。

图1 各单因素对SSR-PCR扩增的影响Fig.1 Effects of each single factor on SSR-PCR

图2 伯乐树SSR-PCR正交试验电泳Fig.2 Electrophoretogram for SSR-PCR orthogonal design of B.sinensis

图3 退火温度对SSR-PCR的影响Fig.3 Effects of annealing temperature on SSR-PCR

图4 最佳反应体系对19份伯乐树样品的SSR-PCR结果Fig.4 SSR-PCR results of 19 materials by the optimal reaction system

3 结 论

SSR-PCR反应体系涉及到Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA的浓度及退火温度等诸多影响因素，各种影响因素之间存在交互作用[11]，本研究采用单因素试验与正交试验相结合对伯乐树SSR-PCR反应体系进行优化，建立了适合于伯乐树的最佳反应体系，这为进一步开展基于SSR标记的伯乐树遗传多样性研究奠定了基础。

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Optimization of SSR-PCR System for Bretschneidera sinensis

YAN Li-jun1, WANG Hong-xia2, HUANG Fang-fang1, HE Chang-qing1, LIANG Yan1, XU Gang-biao1
(1. School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004; Hunan,China; 2. Planning and Design Institute of Forest Products Industry, Beijing 100010, China)

The main factors affecting SSR-PCR system of Bretschneidera sinensis were optimized through single factor experiments and orthogonal design with the leaves of B. sinensis. An optimal SSR-PCR system for B. sinensis was established, containing 1.25 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTP, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.3 µmol/L primers, 90 ng DNA template. This SSR-PCR system lays a foundation for SSR analysis in B. sinensis.

Bretschneidera sinensis; SSR-PCR; reaction system optimization

S718.46

A

1673-923X(2014)12-0083-04

2014-05-13

国家林业公益性行业科研专项（201104033）；十二五国家科技支撑计划（2012BAC01B07－2）

闫丽君（1989-），女，河南卫辉人，硕士研究生，主要从事植物分子群体遗传学研究

徐刚标（1965-），男，安徽枞阳人，教授，主要从事植物种群遗传与林木遗传改良研究；E-mail：gangbiaoxu@163.com

[本文编校：吴 彬]