降胆固醇乳酸菌的筛选及其对小白鼠的不良影响

张开屏， 田建军

（1.内蒙古商贸职业学院 食品工程系，内蒙古 呼和浩特010070；2.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，对维持宿主的微生态平衡和提高免疫功能起着极其重要的作用[1-3]。国外大量研究证实[4-7]，不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的效果。服用乳酸菌及其相关制品，可降低心血管病的发病率。因此从传统发酵制品中筛选出安全高效的降胆固醇乳酸菌，可为今后益生菌制剂和功能性乳制品开发提供优良菌种。

作者以分离自内蒙古传统发酵乳制品中14株乳酸杆菌为研究对象，从中筛选出具有降胆固醇能力较高的乳酸菌，并进行了乳酸菌种的鉴定和灌胃小白鼠的不良影响试验。

1 材料与方法

1.1 实验材料

分离自内蒙古传统发酵乳制品中乳酸菌14株。TPY培养基、MRS培养基、MRS-CHOL培养基：参照文献[12]进行配制；胆固醇、邻苯二甲醛，巯基乙酸钠、正己烷、冰醋酸：均为分析纯；16S rDNA基因序列分析材料：参照文献[14]进行配制；清洁级纯系昆明种小鼠：体重（20±2）g，雌雄各半，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（蒙2002-0001）。

1.2 实验方法

1.2.1 供试菌液的调制 参照文献[11]，对试验菌株进行纯化和革兰氏染色镜检，MRS液体培养基37℃、24 h活化2代，按1%接种体积分数接种MRS三角瓶液体培养（约 120 mL、37 ℃、24 h）然后无菌分装于三支离心管中（约40 mL），按3 000 r/min离心10 min，弃上清液加灭菌生理盐水约30 mL洗涤3次，按3 000 r/min离心10 min，弃上清液，获得菌体细胞，再加20～30 mL灭菌生理盐水，分光光度计调供试菌液活菌数约为3×109CFU/mL。

1.2.2 胆固醇的测定

1）标准曲线的绘制：分析天平精确称量分析纯胆固醇 50.00 mg，参照文献[9，14]，用无水乙醇定容于50 mL的容量瓶中，配成质量浓度为1.0 g/L的胆固醇标液。 精确吸取 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL的胆固醇标准液于50 mL容量瓶中，无水乙醇定容， 得到 10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 mg/L 的梯度溶液。分别取梯度溶液1.0 mL置于20 mL试管中，在通风厨中抽干，然后加入2.0 mL邻苯二甲醛溶液，磁力搅拌器振荡使其充分溶解，10 min后加入1.0 mL的浓H2SO4磁力搅拌器振荡混合均匀，室温条件下放置10 min使其显色，波长550 nm条件下测其OD值，分光光度计用2.0 mL邻苯二甲醛溶液加入1.0 mL的浓H2SO4，混合均匀，室温放置10 min调零。以胆固醇质量百分比浓度为纵坐标，550 nm条件下测的OD值为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

图1 胆固醇质量浓度标准曲线Fig.1 Standard curve of cholesterol concentration

2）样品处理及测定：参照文献[12]，按1%的接种体积分数将供试菌液在MRS-CHOL培养基中37℃厌氧培养24 h后，3 000 r/min离心10 min，取上清液为待测样品，参照文献[9-10，14]，取待测试验样品0.5 mL，加无水乙醇3.0 mL和50%KOH 2.0 mL振荡器混合均匀，60℃水浴恒温10 min，冷却后加正己烷5.0 mL，混合均匀，加双蒸水3.0 mL后再充分混合，室温静置15 min使溶液分层，取正己烷层溶液2.0 mL抽干，加入邻苯二甲醛溶液2.0 mL，室温静置10 min，加入1.0 mL浓H2SO4，混合均匀，放置10 min后，550 nm条件下测OD值。根据标准曲线方程计算样品中胆固醇的质量浓度，进而计算胆固醇降解率R及其单位菌株对胆固醇的去除效力E。

式中：S对照为对照样上清液中胆固醇质量浓度（μg/mL）；S接种为发酵上清液中胆固醇质量浓度（μg/mL）；N 为乳酸菌数的对数值 lg（CFU/g）。

1.2.3 乳酸菌的生理生化试验 对筛选到的菌株进行革兰氏染色，在生物显微镜下观察菌体形态，通过氧化氢酶试验、运动性及产酸、产气、糖发酵等生理生化试验进行鉴定[15]。

参照文献[11、13、16]，采用通用的 16S rDNA 引物进行PCR扩增，得到约1 500 bp的特异性扩增产物，电泳检测扩增产物后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，进而对乳酸菌进行种的鉴定。

1.2.4 菌株N59-1的致病性试验

1）试验小鼠分组及给药：将40只试验小白鼠随机分为两组，雄雌各半，每组20只，其中一组用于空白对照。以约3×109CFU/mL菌液分别灌胃雌雄小鼠，每次每只小鼠灌胃1.0 mL，在24 h内灌胃2次，间隔8 h，取另一管用灭菌脱脂乳制备成相同浓度的菌悬液，空白对照组小鼠每次每只小鼠灌胃1.0 mL脱脂乳培养基，灌胃时间与试验组相同，连续观察30 d，记录观察期间小鼠表现和死亡情况。

2）小鼠死亡记录及组织切片的制作：参照文献[17]，对死亡的小鼠进一步做脏器有无病理变化试验和主要器官心、肝、肾、脾、贲门的组织切片观察。若小鼠没有死亡，试验结束时，则从每组中各取一只小鼠，对小白鼠进行摘眼球取血，制备血片，将取血后的小白鼠脱臼致死，进行组织切片观察。

3）脏器系数的测定[18]：取血完毕脱臼处死小鼠，并小心分离出肝、肾，并立即于分析天平上称量质量，计算脏器系数。

2 结果与分析

2.1 降胆固醇乳酸菌的筛选

按1%的接种体积分数，将供试菌液接种于MRS-CHOL培养基中，与对照样一起在厌氧条件下，37℃培养24 h，分别测定其pH值、培养基中胆固醇的质量浓度，并分别计算单位菌株对胆固醇的去除效力E和胆固醇降解率R，结果见图2～3。图中带有相同子母，表示样品之间差异不显著（P＞0.05），不同子母表示样品之间差异显著（P＜0.05）。

由图2可以看出 ，14株全部试验菌株对介质中胆固醇都有脱除作用，除12和13号菌株外，其它12株菌株与对照样相比差异显著（P＜0.05）。试验菌株对胆固醇的脱除力平均值为6.63 μg/lg（CFU/g），脱除力高于平均6.63 μg/lg（CFU/g）的菌株有7株，代号分别为 2、4、5、6、7、9、11，其中 11 号菌株 N59-1 对胆固醇的脱除力为 14.85 μg/lg（CFU/g），脱除力最高，代号15的菌株对胆固醇的脱除力与平均值相等，脱除力低于平均值 6.63 μg/lg（CFU/g）的菌株有 6 株，代号分别为 3、8、10、12、13、14。 菌株间对胆固醇脱除力的差异显著性，如图2中子母所示，含有不同子母，表示差异显著（P＜0.05）。

图2 乳酸菌对胆固醇的脱除效力Fig.2 Cholesterol removal effectiveness of lactobacillus from media

由图3可以看出，14株全部试验菌株对介质中胆固醇都有一定的降解作用，除12和13号菌株外，其它12株菌株与对照样1相比差异显著 （P＜0.05）。试验菌株对胆固醇的降解率平均值为15.48%，降解率高于平均值15.48%的菌株有7株，代 号 分 别 为 4、5、6、7、9、11、15， 其 中 11 号 菌 株N59-1对胆固醇的降解率为42.97%，降解率最高，降解率低于平均值15.48%的菌株有7株，代号分别为 2、3、8、10、12、13、14。 菌株间对胆固醇降解率的差异显著性，如图3中子母所示，含有不同子母，表示差异显著（P＜0.05）。

结合图2和图3可以看出，菌株对胆固醇的脱除力和菌株对胆固醇的降解率有高度的相关性，降解率高的菌株，脱除力也高，代号11的菌株N59-1，对胆固醇的去除率R高达42.97%，同时单位菌株对胆固醇的去除效力E为14.85，与其它菌株相比差异显著（P＜0.05），故N59-1可作为比较理想的筛选菌株。

图3 乳酸菌对胆固醇的降解率Fig.3 Cholesterol removal rate of lactobacillus from media

2.2 乳酸菌的生理生化鉴定

2.2.1 乳杆菌属的鉴定 采用嗜酸乳杆菌ATCC4356、保加利亚乳杆菌JCM1002和瑞士乳杆菌ATCC12278三株标准菌株作为对照菌株进行乳杆菌属的鉴定。经形态学和生理生化试验对筛选的11号菌株N59-1进行了鉴定，N59-1发酵葡萄糖但不产生气体，属同型乳酸发酵，细胞壁中不含有二氨基庚二酸，产生DL-乳酸，脱脂乳中产酸量为1.3%，试验结果见表1。根据表1及文献[13]，可将试验菌株鉴定为乳酸菌的乳杆菌属。

表1 乳杆菌的生理生化试验鉴定结果Table 1 Consequence on identification Lactobacillus physiological and biochemical experiment

2.2.2 乳杆菌种的鉴定 糖发酵试验结果见表2。由表2可以看出，N59-1均分解木糖、核糖、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、纤维二糖等产酸，不利用肌醇、菊粉、七叶苷、扁桃苷、松三糖、纤维二糖。根据表2，参照文献[4]可将N59-1归为植物乳杆菌。

表2 糖发酵试验Table 2 Capacity of strains to make use of carbon source

用0.8 g/dL的琼脂糖凝胶对试验菌株N59-1的16S rDNA扩增产物做电泳检测，经核酸染料染色后，在1 500 bp处出现荧光条带，与预期一致，然后用回收的产物直接进行16S rDNA序列测定。由菌株N59-1的16S rDNA序列与GenBank数据库中已知的乳杆菌属内标准菌株的16S rRNA/rDNA基因序列同源性百分比对比可知，菌株N59-1的16S rDNA序列与其它乳杆菌的16S rRNA/rDNA序列相似性均大于84%，是乳杆菌属的菌株。而且菌株N59-1与L.plantarum的标准菌株的同源性为99.7%，可以认为该菌株是一株Lb.plantarum。

2.3 菌株N59-1的致病性试验

2.3.1 菌株N59-1对小鼠急性毒性试验结果 以3×109CFU/mL浓度菌液分别灌胃雌雄小鼠，每次每只小鼠灌胃1.0 mL，在24 h内灌胃2次，间隔8 h，观察7 d，结果发现全部小鼠在整个试验过程中精神状态、毛皮、肤色、饮水、进食量、尿色和粪便与对照组小鼠的情况相同，均未发生任何不良反应和死亡情况，表明试验菌株没有引起小鼠的不良反应。

2.3.2 菌株N59-1对小鼠血液的影响 试验观察期30 d时，将每只小白鼠进行摘眼球取血，制备血片。血片结果显示，灌胃试验菌株的小白鼠与对照组的血片相似，细胞分布均匀，形态正常，无异常细胞，白细胞数量正常，没有血小板和红细胞聚集。

2.3.3 菌株N59-1对小鼠重要器官组织形态学的影响 试验观察期30 d时，试验组小鼠肺脏、脾脏、肾脏、心脏与对照组相似。肝脏组织结构正常，肝小叶结构清楚；肺脏结构形态正常，未见明显的病理学改变；脾脏结构形态正常，红髓、白髓清楚可见，无增生，未见异常改变；肾脏皮质、髓质、肾小球结构正常，肾小管上皮细胞无浊肿或脂肪变性；心脏部位心室、心房、心肌纤维结构清楚，横纹清晰可见，为正常结构，未见炎性细胞侵入，间质未见异常。

2.3.4 菌株N59-1对小鼠脏器系数的影响 给食含N59-1菌液30 d称重后，处死小鼠解剖检查心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等全身各脏器，肉眼观察未发现明显异常。取心、肝、肺、肾、脾等靶脏器，用滤纸吸去血液称重，求脏器系数，结果见表3。

表3 菌株N59-1对小鼠脏器系数的影响（X±S，n＝10）Table 3 Effect of strain N59-1 on organ coefficient in mice（X±S，n＝10）

由表3可知，小鼠心脏系数、肝脏系数、肺脏系数、脾脏系数、肾脏系数、脑系数、卵巢或睾丸系数试验组与对照组无显著变化（P＞0.05），可见含N59-1菌液对小鼠无不良影响。

3 结语

1）14株全部试验菌株对MRS-CHOL培养基中胆固醇都有一定的脱除作用，脱除率R在6.84%～42.97%之间，R的平均值为16.59%，其中12株菌株与对照样相比差异显著（P＜0.05），菌株N59-1对胆固醇的脱除率最高，数值为42.97%（P＜0.05）。

2）菌株N59-1与标准菌株L.plantarum的同源性约为99.7%，菌株N59-1可判定为L.plantarum。

3）在30 d的灌胃期内，菌株N59-1在行为、血液和重要器官组织形态学、脏器系数方面，试验组与对照组无显著差异（P＞0.05），可见含N59-1菌液对小鼠无不良影响。

[1]ZHANG Fang，HANG Xiaomin，FAN Xiaobing，et al.Selection and optimization procedure of synbiotic for cholesterol removal[J].Anaerobe，2007，13：185-192.

[2]Papamanoli，Tzanetakis E，Litopoulou-Tzanetaki N，et al.Characterization of lactic acid bacteria isolated from a Greek dryfermented sausage in respect of their technological and probiotic properties[J].Meat Science，2003，65（2）：859-867.

[3]ZHAO Liping，SHEN Jian.Whole-body systems approaches for gut microbiota-targeted，preventive health care[J].Journal of Biotechnology，2010，149（3）：183-190.

[4]Lin S Y，Ayres J W，Winkler W，et al.Lactobacillus effects on cholesterol：in vitro and in vivo results[J].Journal of Dairy Science，1989，72（11）：2885-2889.

[5]KEYS ，ANCEL.Serum cholesterol response to dietary cholesterol[J].American Journal of Clinical Nutrition，1986，44（2）：309.

[6]Liong M T，Shan N P.Effects of a Lactobacillus casei synbiotic on serum lipoprotein，intestinal microflora and organic acids in rats[J].Journal Dairy of Science，2006，89（5）：1390-1399.

[7]JUNGAE J，KIM S，CHO S Y，et al.Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus plantarum KCT3928 by increased bile acid excretion in C57BL/6 mice[J].Nutrition，2009，26（3）：321-330.

[8]WANG Y，XU N，XI A，et al.Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fed on high-vholesterol diet[J].Applied Microbiology Biotechnology，2009，84（2）：341-347.

[9]GILLAND S E，NELSON C R，MAXWELL C.Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus[J].Appl Environ Microbiol，1985，49：377-381.

[10]Rude L L，Morris D M.Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde[J].J Lipid Res，1973，14：364-366.

[11]Kuwahara T，L Norimatsa.Genetic variation in 16S-23S rDNA interal transcribed spacer region and the possible use of this genentic variation for molecular diognosis of Bacteriodes species[J].Microbiol Immunol，2001，45：191-199.

[12]田建军.高效降胆固醇乳酸菌的筛选及其在发酵乳中的应用[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2006.

[13]康白.微生物实验手册[M]．大连：大连出版社，1988.

[14]田建军，张开屏，靳烨.高效降胆固醇乳酸菌的筛选[J].食品科技，2011，11：21-25.TIAN Jianjun，ZHANG Kaiping，JIN Ye.Screening of Lactobacillus for efficient cholesterol-degrading[J].Food Science and Technology，2011，11：21-25.（in Chinese）

[15]布坎南 R E，吉布斯 N E.伯杰氏细菌鉴定手册（第8版）[M].中国科学院微生物研究所译.北京：科学出版社，1984.

[16]王俊国.降胆固醇益生乳杆菌的筛选及其降胆固醇作用的研究[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2008.

[17]田欣田，董文德，邱震东.现代动物病理学实验技术[M].北京：中国农业大学出版社，1992.

[18]GB15193.1-2003.国家标准食品安全学毒理学评价程序[S].北京：中国标准出版社，2003.