高水分固态发酵上部烟叶对其微生物量和化学成分的影响

李士林， 王宜君， 张薄博， 汤朝起， 许赣荣*

（1.江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；2.上海烟草集团有限责任公司，上海 200082）

我国的烟草种植面积、年产量均居世界首位，然而每年也会产生大量的低次烟叶。低次烟叶淀粉、蛋白质等的大分子物质含量过高，化学成分不协调，导致吸食品质差，只能用于低档卷烟的配方中，或者直接丢弃，这不仅严重影响了企业和国家的经济利益，也造成了大量的材料浪费。探索出一种改善低次烟叶品质的方法，是一个值得研究的课题[1-3]。

目前，烟厂处理烟叶的主要方法是以自然陈化为主，人工发酵为辅[4]。自然陈化的温度随着当地温度的变化而变化，最高温度一般不会超40℃。人工发酵的温度大约在45～55℃[5]。自然陈化和人工发酵中，为了防止烟叶发霉，烟叶的水分都限制在质量分数20%以下。由于烟叶水分很低，烟叶发酵速度缓慢，所以两者的发酵周期一般都较长[6-7]。如果提高烟叶水分，可以加速烟叶的发酵。本实验旨在探索低次烟叶在高水分发酵过程中微生物和化学成分的变化，为探索高水分发酵低次烟叶提供一定的理论基础。

烟叶人工发酵的温度主要是常温发酵（30℃左右）和高温发酵（45～55℃），本实验中也采用常温（30℃）和高温（50℃）对烟叶进行好氧和厌氧发酵，并对发酵过程中烟叶微生物数量和化学成分进行测定和研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

上部低次烟叶，由上海烟草集团有限责任公司提供，为2012年福建烟叶；牛肉膏、鱼粉蛋白胨、孟加拉红琼脂、浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、冰醋酸，均购自中国国药集团化学有限公司。H2-2型电热恒温振荡水槽，上海精宏实验设备有限公司制造；UV3000型紫外-可见光分光光度计，日本Hitachi公司制造；FA1004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司制造；PL602-S电子天平，METTLER TOLEDO仪器上海仪器有限公司制造；PB-10型 pH计，SartoriUs公司制造；YHG-300BS型鼓风恒温干燥箱，上海康路仪器设备有限公司制造；Sartorius MA-40型红外线水分测试仪，德国赛多利斯公司制造；PYX-XHS-405型电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂制造；SW-CJ-IFD超净工作台，苏州安泰空气技术公司制造；红外智能8孔消化炉，上海沛欧分析仪器有限公司制造。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 将发酵前后的上部低次烟叶样品剪成碎片，取烟叶碎片1.0 g置于盛有100 mL无菌水的三角瓶中37℃振荡20 min，制成菌悬液，用于菌落计数。

1.2.2 好氧细菌平板计数法 在超净台中将菌悬液稀释成一定浓度，取200 μL均匀涂在肉汤琼脂培养基平板中，于培养箱中37℃培养24 h。

1.2.3 厌氧细菌双层平板计数法 在超净台中取稀释一定浓度的菌悬液200 μL，均匀涂在肉汤琼脂培养基平板中，再倒入一层40℃左右未凝固的肉汤培养基，待冷却凝固后于培养箱中37℃培养24 h。

1.2.4 酵母和霉菌平板计数法 在超净台中取稀释一定浓度的菌悬液200 μL，均匀涂在孟加拉红琼脂培养基平板中，于培养箱中30℃培养2～4 d[8-9]。

式（1）中：Ny为烟叶菌落数，Np为平板中菌落数，单位cfu/g；n为稀释倍数；w为烟叶中含水质量分数；5数字代表200 μL换算成1 mL的系数。

1.3 固态发酵方法

取50 g烟叶，根据含水量的设置安排，加入一定量的蒸馏水，装入500 mL的三角瓶中，在培养箱中，分别于30℃和50℃温度下进行固态发酵。发酵结束后取少许样品测定微生物数量，其余样品于鼓风恒温干燥箱烘干后测化学成分。

1.4 分析方法

1.4.1 烟叶水分的测定 取待测烟叶0.5～1.0 g，放入红外快速水分测定仪中进行测定。

1.4.2 淀粉的测定 采用DNS法：取烟样，粉碎，过80目筛，准确称取烟叶粉末0.6 g，用50 mL体积分数80%酒精浸泡12 h，80℃水浴30 min，过滤，所得到的滤渣用50 mL蒸馏水冲入250 mL的烧杯中，加入7 mL盐酸溶液（浓盐酸与蒸馏水体积比为5∶4），于烘箱中105 ℃处理 2.5 h，用 NaOH 溶液调节pH至中性后定容到100 mL，即为淀粉待测液，按照文献[10]的方法对淀粉待测液进行测定。

1.4.3 蛋白质的测定 采用凯氏定氮法：准确称取0.500 g 80目烟样粉末（精确至0.001 g），置于250 mL的烧杯中，加入50 mL质量分数0.5%醋酸，加热煮沸15 min，迅速用定量滤纸真空抽滤，并用质量分数0.5%醋酸冲洗锥形瓶和沉淀物至滤液无色，然后将滤纸和残渣转移至消化管中，加入0.4 g硫酸铜、10 g硫酸钾及10 mL浓硫酸，于红外消化炉中进行高温消化，待液体呈蓝绿色澄清透明后，取下冷却，加入20 mL水，此为蛋白质待测液。具体测定方法见文献[11]。

公式（2）（3）中：rs为淀粉降解率，ws1为原烟叶淀粉质量分数，ws2为发酵后烟叶淀粉质量分数；rp为蛋白质降解率，wp1为原烟叶蛋白质质量分数，wp2为发酵后烟叶蛋白质质量分数。烟叶淀粉和蛋白质的质量分数均为烟叶干基中淀粉和蛋白质质量分数。

2 结果与讨论

2.1 上部低次烟叶30℃好氧发酵过程中微生物数量和化学成分的变化

在常温好氧发酵过程中，烟叶中微生物数量、淀粉和蛋白质的变化及烟叶水分质量分数和发酵时间有着密切的关系，作者所在实验室中烟叶水分质量分数分别设为30%、40%、50%、60%，发酵温度为30℃，发酵过程中定期取样。当烟叶水分质量分数为30%和40%时，发酵到第3天烟叶发霉，遂停止发酵。当烟叶水分质量分数为50%和60%时，发酵到第2天烟叶发霉，遂停止发酵。因此烟叶水分含量较高时，易长霉。这也是烟叶常温下一般控制在低水分条件下的原因。

2.1.1 上部低次烟叶30℃下好氧发酵过程中微生物数量的变化 本实验对不同水分质量分数、30℃下好氧发酵上部低次烟叶过程中微生物数量进行取样检测，结果如表1和表2所示。

由表1可见，在30℃好氧发酵上部低次烟叶过程中，酵母随着发酵时间的延长而大量繁殖。发酵水分对酵母的生长有较大促进作用，发酵水分越高，酵母繁殖越快；好氧细菌的数量随着发酵时间的延长而降低。烟叶物料水分对好氧细菌有明显的影响，好氧细菌数量随着烟叶物料水分的增多而递减。好氧细菌随着发酵时间的延长逐渐减少，而酵母和霉菌（见表2）则随着发酵时间的延长而快速繁殖。细菌的变化和酵母、霉菌的变化呈现负相关性，可能是酵母和霉菌的大量繁殖，抑制了细菌的繁殖。

表1 上部低次烟叶30℃下好氧固态发酵过程中好氧细菌和酵母数量的变化Table 1 Changes of the amount of aerobic bacteria and yeast in tobacoo during aerobic fermentation in 30℃cfu/g

表2 上部低次烟叶30℃下好氧固态发酵过程中霉菌数量的变化Table 2 Changes of mould amount in tobacoo during aerobic fermentation in 30℃ cfu/g

由表2可见，在30℃好氧发酵上部烟叶过程中，霉菌大量繁殖。发酵水分越高，越利于霉菌的生长。当烟叶物料水分质量分数为30%～40%时，烟叶发酵到第3天开始发霉，出现霉菌斑点，用肉眼可以清晰地看出。当发酵烟叶水分质量分数为50%～60%时，烟叶发霉时间提前到第2天。由数据和观察现象可见，当烟叶中霉菌的数量达到104cfu/g时，便出现霉菌斑点，用肉眼就可以发现。

2.1.2 上部低次烟叶30℃下好氧固态发酵过程中化学成分的变化 对30℃下好氧发酵上部低次烟叶发酵过程中烟叶的淀粉和蛋白质质量分数进行定期取样检测，结果如图1所示。可见，在30℃下好氧固态发酵上部低次烟叶过程中，烟叶中淀粉的质量分数随着发酵时间的延长而逐渐降低；当烟叶物料水分质量分数为30%～40%时，烟叶中蛋白质的质量分数随着发酵时间的延长而逐渐降低；当烟叶物料水分质量分数超过40%时，烟叶中蛋白质的质量分数随着发酵时间的延长而出现先降低后不变的趋势。这可能是当烟叶物料水分质量分数超过40%时，酵母大量繁殖，酵母菌体蛋白质增多，从而间接增加了烟叶中蛋白质的质量分数。

图1 上部低次烟叶30℃好氧固态发酵过程中烟叶淀粉和蛋白质质量分数的变化Fig.1 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during aerobic fermentation in 30℃

2.2 上部低次烟叶30℃下厌氧发酵过程中微生物数量和化学成分的变化

烟叶厌氧发酵，霉菌生长受到抑制，故可以适当延长发酵时间。本实验设计烟叶发酵水分质量分数为30%、40%、50%、60%，发酵温度为30℃，在第4天、第8天、第12天取样测微生物数量和烟叶淀粉和蛋白质等化学成分。

2.2.1 上部低次烟叶30℃下厌氧固态发酵过程中微生物数量的变化 对30℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程微生物数量定期取样检测，见如表3。

表3 上部低次烟叶30℃下厌氧固态发酵过程中厌氧细菌和酵母数量的变化Table 3 Changes of the amount of anaerobic bacteria and yeast in tobacoo during anaerobic fermentation in 30℃cfu/g

由表3可见，在30℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中，烟叶厌氧细菌的数量随着发酵时间的延长呈缓慢下降的趋势。烟叶物料水分对厌氧细菌的生长有明显促进作用，发酵水分越高，厌氧细菌数量越多；当烟叶发酵水分质量分数超过40%，发酵前4 d，酵母大量出现，但随着发酵时间的延长，酵母的数量增加很慢，基本趋于平衡。这可能是由于自封袋的发酵环境刚开始会存在少量空气，酵母利用这些少量的氧气进行繁殖。当发酵时间超过4 d以后，酵母的数量不再有明显增长，说明发酵环境中的氧气被酵母完全消耗而进入厌氧环境。酵母进行厌氧发酵，繁殖减慢。

2.2.2 上部低次烟叶30℃下厌氧固态发酵过程中化学成分的变化 对30℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中烟叶淀粉和蛋白质质量分数进行定期检测，结果如图2所示。可见，在30℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中，烟叶淀粉和蛋白质的质量分数都随着发酵时间的延长而降低。烟叶物料水分的提高会加快烟叶淀粉和蛋白质的降解。由表3可知，烟叶物料水分的增加会促进厌氧微生物繁殖，这可能是烟叶淀粉和蛋白质的降解加速的原因之一。

2.3 上部低次烟叶50℃下好氧固态发酵过程中微生物数量和化学成分的变化

50℃发酵时，霉菌已经不再生长，故可以延长发酵时间。50℃也不是大多数细菌生长的适宜温度，50℃固态发酵上部低次烟叶必然会对烟叶中的微生物产生明显的抑制作用。本实验设计发酵温度为50℃，发酵水分质量分数为30%、40%、50%、60%，在第4天、第8天、第12天取样测微生物数量和烟叶的化学成分。

图2 上部低次烟叶30℃厌氧固态发酵过程中烟叶淀粉和蛋白质质量分数的变化Fig.2 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during anaerobic fermentation in 30℃

2.3.1 上部低次烟叶50℃下好氧固态发酵过程中微生物数量的变化 对50℃下好氧固态发酵上部低次烟叶过程微生物数量定期检测，见表4。

表4 上部低次烟叶50℃下好氧固态发酵过程中好氧细菌和霉菌数量的变化Table 4 Changes of the amount of aerobic bacteria and mould in tobacoo during aerobic fermentation in 50℃ cfu/g

由表4可见，在50℃下好氧固态发酵上部低次烟叶过程中，好氧细菌的数量随着发酵时间的延长而迅速减少。烟叶物料水分的提高不利于好氧细菌的生长代谢，随着烟叶物料水分的增加，好氧细菌的数量逐渐减少；霉菌还是会少量生长，但数量较少，烟叶表面也没有观察到霉菌菌落，如此少量的霉菌尚不能影响烟叶的吸食品质。由此可见，发酵温度为50℃时可以较好地解决高水分发酵烟叶过程中霉菌的生长问题；50℃好氧固态发酵上部低次烟叶过程中，酵母已经不再生长繁殖，故表4没有列出。可见，烟叶中自带的酵母在50℃厌氧固态发酵过程中无法生长繁殖。

2.3.2 上部低次烟叶50℃下好氧固态发酵过程中化学成分的变化 对50℃好氧发酵上部低次烟叶过程中烟叶淀粉和蛋白质质量分数进行定期检测，结果如图3所示。

图3 上部低次烟叶50℃下好氧固态发酵过程中淀粉和蛋白质质量分数的变化Fig.3 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during aerobic fermentation in 50℃

由图3可见，在50℃好氧固态发酵上部低次烟叶过程中，烟叶淀粉和蛋白质的质量分数都随着发酵时间的延长而降低。烟叶物料水分的增加会加快烟叶淀粉和蛋白质的降解。50℃可能是烟叶本身自带复合酶的适合温度，水分的提高会提高复合酶水解淀粉和蛋白质的效果。

2.4 上部低次烟叶50℃下厌氧固态发酵过程中微生物数量和化学成分的变化

本实验设计发酵温度为50℃，烟叶物料水分质量分数为30%、40%、50%、60%，厌氧发酵第4天、第8天、第12天取样测微生物数量和烟叶淀粉和蛋白质等化学成分。

2.4.1 50℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中微生物数量的变化 对50℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中微生物数量进行定期检测，结果如表5所示。由表5可见，在50℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中，烟叶厌氧细菌的数量随着发酵时间的延长呈缓慢下降的趋势。烟叶物料水分对厌氧菌有明显抑制作用，烟叶物料水分越多，厌氧细菌数量越少；在此条件下酵母没有生长繁殖，故没有在表5列出，结合表4分析可见，烟叶中自带的酵母在50℃下无法生长繁殖。

表5 上部低次烟叶50℃厌氧固态发酵过程中烟叶厌氧细菌和酵母数量的变化Table 5 Changes of the amount of anaerobic bacteria and yeast in tobacoo during anaerobic fermentation in 50℃ cfu/g

2.4.2 上部低次烟叶50℃下厌氧固态发酵过程中烟叶化学成分的变化 由图4可见，在50℃下厌氧固态发酵上部低次烟叶过程中，烟叶淀粉和蛋白质的质量分数随着时间的增长而逐渐降低。

图4 上部低次烟叶50℃厌氧固态发酵过程中烟叶淀粉和蛋白质质量分数的变化Fig.4 Changes of the content of starch and protein in tobacoo during anaerobic fermentation in 50℃

烟叶物料水分越高，淀粉和蛋白质的降解率越高。50℃可能是烟叶本身自带复合酶的适合温度，水分的增加会提高复合酶水解淀粉和蛋白质的效果。

3 结语

研究了高水分固态发酵上部烟叶过程中烟叶微生物数量和化学成分的变化。结果表明：在常温好氧发酵中，烟叶发酵到第二三天开始发霉，发酵被迫终止。发酵过程中好氧细菌逐渐减少，酵母和霉菌大量繁殖；常温厌氧发酵过程中，厌氧细菌小幅度减少，酵母数量发酵前期迅速增加，发酵到第4天后数量趋于稳定；高温好氧和厌氧发酵过程中，酵母和霉菌不再生长，好氧细菌和厌氧细菌均大幅度减少。常温和高温发酵过程中，烟叶淀粉和蛋白质的质量分数均随着时间的延长而逐渐降低。

通过本实验研究发现，高温高水分条件下发酵烟叶在防止霉菌生长的同时，大幅度地降低了低次烟叶中淀粉和蛋白质的质量分数。这为下一步利用高温高水分发酵低次烟叶来改善低次烟叶的品质，提供了一定的研究基础。

本实验仅仅研究了烟叶在高水分发酵过程中烟叶微生物、淀粉和蛋白质质量分数的变化，烟叶其他化学成分的变化，以及对烟叶吸食品质的影响，则有待于进一步的研究。

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