南方鲇饲用嗜酸乳杆菌微囊化研究

许青莲， 邢亚阁*， 车振明， 蒋 丽， 张丽珠， 蔡义民

（1.西华大学生物工程学院食品生物技术重点实验室，四川成都 610039；2.日本农业科学国际研究中心，日本筑波 30528686）

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是动物肠道有益微生物之一，可以维持肠道正常菌群的生态平衡，增强机体免疫力，促进消化，合成氨基酸和维生素等。嗜酸乳杆菌还可阻止病原菌对肠道的入侵和定植，防止多种疾病和不良反应的发生，在机体中发挥着重要的生理作用。但是，由于嗜酸乳杆菌对环境因素（氧、水分和高温）、机械挤压、热激以及胃酸等都非常敏感，稳定性较差，极大地限制了它的广泛应用（赵瑞香，2007）。

微囊化技术是用特殊手段将固体、液体、气体等物质包埋在一个微小封闭的胶囊内的技术，改变物质的色泽、形状、耐热性和储藏性等（吴晓，2011）。目前，利用微囊化制备技术保护益生菌是国内外研究的热点之一，它能显著提高益生菌抗热、抗压和抗胃酸能力，使其以活性状态到达肠道，发挥功效。该技术还能保护益生菌免受噬菌体的侵害，提高其在冷冻干燥过程中的存活，增加贮藏过程中的稳定性（张志焱，2012）。

本研究以多孔淀粉、甘油、葡萄糖、甘露醇四种不同物质作为保护剂，利用真空冷冻干燥技术制成微胶囊，研究这四种不同保护剂对制作微生态制剂的影响，并对其外观形态和稳定性能等进行了研究。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料、试剂与仪器 嗜酸乳杆菌，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 6075）；多孔淀粉由辽宁立达生物科技有限公司提供；甘油由常州市无明化工有限公司提供；葡萄糖由常州市金文化工有限公司提供；甘露醇由郑州康源化工有限公司提供；Heto lyolab3000型冷冻干燥机 （丹麦Heto公司）；JSM-7500F扫描电镜（日本电子株式会社）。

1.2 试验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌微生态制剂制备工艺 取样品菌粉1 g，溶于100 mL 2%葡萄糖溶液（已灭菌）中，37℃静置活化30 min，然后以无菌方式按5%的接种量接种于MRS液体培养基（已灭菌）中，摇匀，（37±1）℃恒温培养 18 h。将离心后的菌体用灭菌后的生理盐水适当稀释，调整活菌浓度至108cfu/mL，以备用。在无菌操作条件下，称取一定量的保护剂于烧杯中，加入浓度为108cfu/mL菌悬液50 mL，用氢氧化钠和盐酸调整pH值为6.0后，在20℃无菌条件下振荡40 min，至完全吸附，加入2%海藻酸钠溶液（无菌），搅拌均匀。用胶头滴管将制作好的保护剂溶液挤入2%的氯化钙溶液（无菌）中，固化30 min成膜。用3.5%氯化钙溶液浸泡10 min进行硬化。过滤取得样品，用清水漂去表面的氯化钙残液，再用灭菌的生理盐水（0.85%）洗涤微胶囊表面菌体。在-40℃的超低温冰箱中预冻4 h以上，然后在温度为-58℃的冷冻干燥机进行冷冻干燥24 h，使其水分含量小于3%，即得嗜酸乳杆菌微生态制剂，将冻干后的微胶囊进行真空包装，在4℃冰箱中保藏。

1.2.2 单因素试验 多孔淀粉用量对包埋率的影响：配制活菌浓度为108cfu/mL 50 mL的菌液于250 mL烧杯中，调pH为6.0，加入无菌的多孔淀粉作为保护剂，加入量分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g，然后按1.2.1所述工艺制备微生态制剂，分析不同淀粉加入量对包埋率的影响。

葡萄糖用量对包埋率的影响：配制活菌浓度为108cfu/mL 50 mL的菌液于250 mL烧杯中，调pH为6.0，加入无菌的葡萄糖作为保护剂，加入量分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g， 然后按 1.2.1 所述工艺制备微生态制剂，分析不同葡萄糖加入量对包埋率的影响。

甘油用量对包埋率的影响：配制活菌浓度为108cfu/mL 50mL的菌液于250 mL烧杯中，调pH为6.0，加入无菌的甘油作为保护剂，加入量分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 然后按 1.2.1 所述工艺制备微生态制剂，分析不同的甘油加入量对包埋率的影响。

甘露醇用量对包埋率的影响：配制活菌浓度为108cfu/mL 50 mL的菌液于250 mL烧杯中，调pH为6.0，加入无菌的甘露醇作为保护剂，加入量分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 然后按 1.2.1 所述工艺制备微生态制剂，分析不同的甘露醇加入量对包埋率的影响。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验结果，选择多孔淀粉、葡萄糖、甘油、甘露醇用量4个因素分别设置了3个水平，并特设了一个零水平，因素与水平见表1。

表1 因素与水平

1.2.4 包埋率测定 包埋的活菌数与原始活菌数的比率即为包埋率。微胶囊包埋效果的测定采用曹永梅等（2002）的方法进行。活菌计数依据GB 4789.35-2010标准进行。

1.2.5 形态表征 在扫描电镜样品台上贴上双面胶，均匀粘贴少量微生态制剂粉末。然后喷金，采用JSM-7500F SEM观察，电压为12kV，观察微生态制剂的形貌。

1.2.6 贮存稳定性分析 将冻干的微生态制剂分别置于0、4、25、37℃的条件下贮存6周，每隔一周取样，测定微生态制剂中的活菌数，以此来评价其贮存稳定性和最佳贮存温度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 多孔淀粉用量对微胶囊化的影响 由图1可知，随着多孔淀粉用量的增加，包埋率先增加后降低，当多孔淀粉用量在5 g时，制剂的包埋效果最好。多孔淀粉颗粒的孔洞对嗜酸乳杆菌有一定的容纳数量，即饱和度，当达到该饱和度时，多孔淀粉添加量的增加不会引起包埋率的增加。另外当多孔淀粉用量较低或较高时，会使制成的微囊粒径过小或过大，造成微胶囊的收集困难，使包埋率降低。因此，添加多孔淀粉作单一保护剂时，选择4 g较适宜。

图1 多孔淀粉用量对微胶囊化的影响

2.1.2 葡萄糖用量对微胶囊化的影响 由图2可知，随着葡萄糖用量的增加，包埋率先增加后降低。当葡萄糖用量为5 g时，此时的包埋率最高，为52.5%，当葡萄糖的用量增加时，包埋率随着用量的增加而降低。因此，单一添加葡萄糖作为保护剂时，选择4 g较适宜。

图2 葡萄糖用量对微胶囊化的影响

2.1.3 甘油用量对微胶囊化的影响 由图3可知，当加入甘油小于4.0 mL时，随着甘油量的增加，微生态制剂中的活菌数也相应的增加，包埋率呈现增高的趋势。其主要原因在于：甘油在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，减轻了细胞外溶质浓度升高所造成的细胞损伤，达到了保护的目的。在载体中加入细胞保护剂甘油，加强了冷冻干燥和复水后微囊中细胞的活性（Favaro-Trindade等，2011）。因此，添加甘油作为单一保护剂时，选择4.0 mL较适宜。

图3 甘油用量对微胶囊化的影响

2.1.4 甘露醇用量对微胶囊化的影响 由图4可知，当加入的甘露醇用量小于3.0 mL时，随着甘露醇量的增加，微胶囊中的活菌数也相应的增加，包埋率也有所增加，当加入甘露醇用量大于3.0 mL时，随着甘露醇量的增加，微胶囊中的活菌数反而减小，包埋率也随之下降。因此，添加甘露醇作单一保护剂时，选择3.0 mL较适宜。

图4 甘露醇用量对微胶囊化的影响

2.2 正交试验结果与分析

2.2.1 试验结果直观分析 由表2可见，零水平所代表的单因素试验的最优值即A2B2C3D1所得的包埋率值最大，为63.1%，而通过极差分析所得的最适条件是A3B2C2D1，即正交试验中的第5组，包埋率为62.5%。利用正交试验所选用的4种壁材制备微胶囊，在包埋过程中，溶液中的嗜酸乳杆菌菌体先到达多孔淀粉颗粒周围，然后在通过甘油、葡萄糖和甘露醇等保护剂的作用下，再通过吸附力进入颗粒内部的孔洞中，对嗜酸乳杆菌起到很好的保护作用（Nag等，2011）。

表2 正交试验结果直观分析

2.2.2 方差分析 通过对试验结果的极差分析可以看出，4种因素的主次顺序依次是：多孔淀粉用量（A）> 甘油用量（C）>甘露醇用量（D）>葡萄糖用量（B）。通过对试验结果进行二次方差分析，结果如表3所示，可以明显看出，因素A和C对结果具有显著性影响，也就是说制备微胶囊所选用的4种壁材中，多孔淀粉用量和甘露醇用量对微胶囊的包埋率影响最大。

表3 方差分析结果

2.2.3 验证性试验 为了优选出制备微胶囊的最佳因素组合，分别以单因素试验的最优值即A2B2C3D1和通过极差分析所得的最优条件即A3B2C2D1进行3次重复性试验，所得包埋率结果如表4所示。

表4 微胶囊化壁材工艺验证 %

由表4可以看出，因素组合为A3B2C2D1的方案可行，所以制备微胶囊所选用壁材的最佳工艺条件为：50 mL菌悬液中，采用多孔淀粉用量为6 g、葡萄糖5 g、甘油3.0 mL、甘露醇3.0 mL，此种方案所制备的微胶囊包埋率相对最高。

2.3 扫描电镜 对嗜酸乳杆菌微生态制剂样品进行形态观察，发现嗜酸乳杆菌被保护剂包覆而形成球状颗粒，且微胶囊大小均匀，其表面比较致密，微生态制剂颗粒表面上有很多小孔，多孔淀粉上的这些小孔具有吸附作用，对嗜酸乳杆菌起到了很好的保护作用。但在扫描照片中仍出现了少量的团聚。这应该是在微胶囊的制作过程中搅拌速率过小、或壁材量稍多、或保护剂之间的粘连作用等，造成微胶囊有一定的团聚。

2.4 贮存稳定性分析 将制得的微生态制剂样品[活菌数为（2.5±0.5）×108]和裸菌[活菌数为（1.0±0.5）×108] 分别放在 0、4、25、37 ℃的环境中（环境无特殊要求）保存，每隔一定时间对两种样品的活菌数进行计算，试验结果如表5和表6。由表5可知，制剂组中，随着储藏时间的延长所有制剂样品的活菌数均逐渐下降，但在4℃下贮存时，所计数得到的活菌数下降较为缓慢，相比于其他温度下的保存结果，要适于保存。由表6可知，裸菌组中，所有样品计数得到的活菌数下降剧烈，各温度下3周后基本无存活，在25℃和37℃下，2周就基本无存活。因此，制剂的稳定性明显高于裸菌，在4℃的环境中，嗜酸乳杆菌的活性保存的比较好。

表5 微生态制剂的贮存稳定性 cfu/g

3 结论

目前，微生态制剂已经在食品加工及各种养殖业中得到广泛应用，但南方鲇饲用微囊化嗜酸乳杆菌微生态制剂的研究少见。壁材选择和制备工艺参数的优化是决定微胶囊性能的关键因素。因此，本研究重点优化选择适宜的壁材和浓度，利用真空冷冻干燥技术制备微胶囊，优化工艺参数，通过扫描电镜照片分析表明，嗜酸乳杆菌被均匀的包裹，且大小均匀，有着很好的包裹率，经过稳定性分析，表明制剂的贮藏稳定性明显高于裸菌，且所制得的微生态制剂在4℃下贮存时，稳定性较好。

表6 裸菌的贮存稳定性 cfu/g

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