南林895杨树GmNHX1基因的转入及其耐盐性分析

孙伟博，邓大霞，杨立恒，诸葛强

(南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，江苏南京210037)

盐胁迫是全球范围内影响作物产量最大的非生物胁迫之一，盐胁迫能通过渗透胁迫、离子毒害和离子失衡来抑制植物生长［1］.杨树是营造生态公益林和短周期工业原料林的重要树种，采用基因工程手段培育多抗性的速生、丰产、优质杨树新品种，比常规育种更快更容易选育出具有重要经济价值的杨树新品种，是近年来林木遗传改良的重要研究领域［2－4］.然而土地盐碱化严重制约了杨树速生林的可持续发展.加强杨树的抗盐机理研究，对加速林业经济的持续发展、进一步改善盐渍土地环境以及对其综合开发利用有重大意义.

土壤中包含很多离子，如Cl－、Na+、K+、Ca2+、、Mg2+和SO2－4等，这些离子在通常情况下作为土壤供给植物的营养成分，而当这些离子的浓度升高到对植物生长产生不良影响时，便会造成离子胁迫而发生盐害［5］.在盐渍条件下，对盐胁迫敏感的植物所吸收的多余盐离子主要集中在细胞质中，影响一些酶的活性，因而外界盐度过高就会抑制其生长;而耐盐植物会把吸收的Na+离子通过区域化作用将其贮存在液泡内，从而不受离子的毒害作用［6］.GmNHX1基因编码大豆细胞中液泡膜Na+/H+转运蛋白，能够有效地将Na+区隔化至液泡中，减轻Na+造成的毒害［7］.本研究采用GmNHX1基因转化南林895杨树，以期了解GmNHX1基因的表达对转基因杨树耐盐性的影响.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物材料 遗传转化受体材料为南林895杨树(Populus deltoides×P.euramericana cv.‘Nanlin895’)叶片再生植株，培养于光照培养室，温度 25 ℃，光强30－45 μmol·m－2·s－1，光周期16 h·d－1.

1.1.2 菌株与载体 试验中所使用的大肠杆菌为DH5α(本实验室保存)和One Shot® ccdB SurvivalTM2T1R Competent Cells(购自Invitrogen公司)，农杆菌菌株为EHA105(本实验室保存).

植物表达载体为pGWB402Ω，由岛根大学Tsuyoshi Nakagawa教授惠赠，由Gateway系统的表达载体pGWBs连接2x35s-Ω启动子制备获得.载体图谱如图1所示.

图1 植物表达载体pGWB402Ω图谱Fig.1 Binary vector pGWB402Ω

1.2 方法

1.2.1 载体的构建 利用Invitrogen公司的Gateway技术将耐盐相关基因GmNHX1构建到植物表达载体pGWB402Ω.

1.2.2 GmNHX1基因的遗传转化 采用农杆菌侵染叶盘法介导转化南林895杨树，农杆菌菌株为EHA105.遗传转化条件为:预培养时间3 d，菌液D600nm为0.8，侵染时间15 min，共培养时间4 d.头孢霉素含量在分化期为100 mg·L－1，在生根阶段适度降低，从而保证转化植株的快速生长.卡那霉素在分化阶段的筛选含量为20 mg·L－1，在生根阶段的筛选含量为10 mg·L－1.

1.2.3 转GmNHX1基因的分子检测 选择经卡那霉素抗性筛选获得的转基因植株进行PCR和Southern杂交分子检测.PCR检测:根据转基因植株GmNHX1的片段特异性设计引物(F:3'-ATGGTTTTTGAAATCAGTACTGTTG-5'.R:3'-TCAACGCCATTGATGGCC-5').采用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ(Roche公司提供)进行探针的制备及后期的Southern杂交.

1.2.4 转GmNHX1杨树耐盐性分析 试验共获得6个转基因株系，其中N1、N17和N21株系植株样本量充足.选取生长健壮、大小基本一致的未转基因南林895杨树和转GmNHX1基因杨树植株，置于NaCl浓度分别为50、100、150、200和300 mmol·L－1的无菌营养液中，于第15天测定各组杨树叶片的叶绿素相对含量、可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量以及保护酶活性等生理指标.采用便携式叶绿素计(SPAD-502)对标记叶片的相对叶绿素含量进行测定，6个重复，每个重复测定30次，取其平均值作为该叶片的相对叶绿素含量.采摘植株上部成熟叶片进行可溶性蛋白(Pr)、MDA含量和保护酶活性的测定.可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定［8］.MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)方法测定［9］.按改进的陈建勋等方法［10］进行POD活性的测定.SOD活性采用改良的NBT法进行测定［11］.

2 结果与分析

2.1 GmNHX1基因表达载体的构建

LR反应后提取质粒进行检测，在13 kb处有特异性条带，质粒大小符合预测结果(图2).表明经过LR反应，GmNHX1基因已经从入门载体转移到最终的植物表达载体上.为防止假阳性结果对后续试验的干扰，对pGWB402Ω-GmNHX1质粒进行进一步检测.

对重组的含有GmNHX1基因的表达载体进行菌液PCR检测，在1.6 kb处显示有特异性条带，表明GmNHX1基因已连接入最终的植物表达载体中(图3).PCR扩增检测为阳性的重组子经进一步测序验证，结果表明所有测序样品均为阳性.采用Gateway技术快速构建GmNHX1基因的植物表达载体，对南林895杨树进行遗传转化.

2.2 转基因植株的分子检测

对经抗生素筛选为阳性的转pGWB402Ω-GmNHX1南林895杨树植株进行PCR分子检测.从图4可见:在正对照质粒和转基因杨树6个不同株系中扩增得到了目的片段，即 1、2、11、17、21、22 号，而阴性对照没有特异性扩增条带，说明GmNHX1已经成功整合到南林895杨树基因的基因组中.

2.3 PCR阳性植株的Southern检测

实验室克隆质粒的污染及转基因嵌合体的存在，都会造成PCR检测的假阳性结果.因此，对PCR检测为阳性的转基因植株和对照南林895植株在盐胁迫后采用Southern杂交进行检验比对，PCR 检测为阳性的 6 个株系 1、2、11、17、21、22 均表现为阳性(图5)，表明GmNHX1基因已转入并整合到南林895杨树基因组中.

图2 LR反应构建表达载体pGWB402Ω-GmNHX1质粒检测Fig.2 Detection of expression vector pGWB402Ω-GmNHX1 derived from LR reaction

2.4 转GmNHX1南林895杨树耐盐性分析

2.4.1 盐胁迫浓度对转GmNHX1基因杨树植株叶片叶绿素相对含量的影响 叶绿素含量的高低在某种程度上与光合作用有关.由图6可知，随着盐浓度的提高，对照组和转GmNHX1基因组杨树叶片的叶绿素相对含量都逐渐降低，但对照组的降幅比3个转基因株系的大.随着盐胁迫浓度从最低值上升到最高值，CK、N1、N17 和 N21 株系叶绿素相对含量降幅分别为 625.81%、102.72%、87.75%和97.50%，统计分析结果表明，3个转基因组株系与对照组差异显著.300 mmol·L－1盐胁迫下，对照组的叶绿素相对含量仅为转基因植株N1、N17和N21株系的25.94%、25.59%、25.86%，统计分析结果表明，该浓度下转基因植株与对照组差异显著.

图3 LR重组子的PCR检测Fig.3 PCR detection for clones derived from LR reaction

图4 转基因植株GmNHX1基因PCR检测Fig.4 PCR detection of GmNHX1 in transgenic plants

2.4.2 盐胁迫浓度对转GmNHX1基因杨树植株叶片可溶性蛋白含量的影响 在盐胁迫过程中，随着盐胁迫浓度的提高，对照组转基因N1和N21株系杨树叶片的可溶性蛋白含量逐渐降低.可溶性蛋白含量的降低可能与盐胁迫下蛋白质合成受阻有关.而N17叶片可溶性蛋白含量表现为先升高后降低的趋势.总体上看，对照组叶片可溶性蛋白含量的降幅均大于3个转基因株系(图6).除300 mmol·L－1NaCl处理外，其余不同浓度盐胁迫下，3个转基因株系的可溶性蛋白含量均与CK差异显著.

图5 转基因植株Southern杂交检测Fig.5 Southern blot analysis of transgenic plants

2.4.3 不同盐浓度对转GmNHX1基因杨树植株叶片MDA含量、SOD活性和POD活性的影响 从图6可以看出，随着盐胁迫浓度的提高，对照和3个转基因株系杨树叶片的MDA含量逐渐提高，其总体变化趋势与叶绿素相对含量的变化趋势相反.3个转基因株系的MDA含量的增幅比对照组小.150和200 mmol·L－1NaCl盐胁迫下，N1、N17和N21三个株系的MDA 含量分别为 CK 组的 66.27%、69.69%、73.01% 和 70.75%、70.28%、77.20%.统计分析表明，3 个转基因株系的MDA含量均与CK差异显著.3个转基因株系的MDA含量变幅差异不大，300 mmol·L－1NaCl盐胁迫下，转基因株系N1与其他2个转基因株系差异显著.

盐胁迫15 d后各株系的SOD活性均随着盐胁迫浓度的升高而逐渐降低，表现为一定的浓度效应.但随着盐胁迫浓度的升高，3个转基因株系SOD活性的降幅比对照组小(图6).盐胁迫浓度从50 mmol·L－1升高到300 mmol·L－1，对照组植株的SOD活性降幅高达442.41%，而转基因N1、N17和N21株系的降幅仅为114.62%、106.79%和118.64%，表明转基因植株的SOD活性降幅均与对照有显著差异.3个转基因组株系的SOD活性变幅差异不大.

图6 不同浓度NaCl处理对转抗盐基因杨树植株叶片叶绿素相对含量、可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD活性和POD活性的影响Fig.6 Effects of different concentrations of salt stress on the chlorophyll relative content，soluble protein content，MDA content，SOD activity and POD activity

对照组和转基因植株的POD活性随着胁迫浓度的升高均表现为先升高后降低的变化趋势，均以100 mmol·L－1盐胁迫处理的活性最高.对照组的峰值较3个转基因株系低，峰型平缓;而转基因植株峰型较陡.与对照组株系相比，在高浓度盐胁迫下转基因植株POD活性降幅减小(图6).50 mmol·L－1盐胁迫下转基因株系与对照差异不显著，其余各种浓度盐胁迫下转基因株系叶片的POD活性均与对照组差异显著.测得的耐盐性各项生理数据表明，与对照组植株相比，转抗盐基因杨树幼苗在盐胁迫下GmNHX1基因得到表达，在一定程度上减轻了盐胁迫对杨树幼苗的毒害作用.

3 小结与讨论

本研究结果表明:随着盐胁迫浓度的提高和胁迫时间的延长，对照植株叶绿素相对含量降幅、可溶性蛋白含量降幅以及MDA含量增幅均低于对照植株;在100－300 mmol·L－1浓度下，转基因植株的POD活性变化与对照植株有显著差异.本研究结果还表明:转抗盐基因杨树植株在盐胁迫下诱导GmNHX1的表达，同样能够提高杨树植株的抗盐能力;而转基因植株个体间耐盐性的表达水平有差异，可能与外源基因的插入位点及调控方式不同有关.

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