液相色谱-二极管阵列检测／质谱联用在活性染料结构鉴定中的应用

付新梅 ， 张 蓉， 吴祖望

（大连理工大学，精细化工国家重点实验室，辽宁 大连116024）

2013 年我国染料总产量已达89.5 万吨，居世界首位［1］。而活性染料在1956 年问世以后，因其色谱齐全、制造方便、成本低廉、应用较广而得到快速发展，已成为仅次于分散染料，占染料总产量第二位的一大类染料。在活性染料的发展过程中，染料结构鉴定对于借鉴世界前沿的研究成果、掌握当前优秀性能染料的结构信息，从而促进我国染料工业的发展具有重要作用。

20 世纪60 年代以前，对未知染料的结构鉴定多采用化学裂解法。该方法是先将复杂的染料分子用一定的降解方法裂解成分子较小的碎片，然后用化学方法得到裂解碎片的颜色和反应性能等信息从而推测结构。其过程繁琐，准确度差［2］。在近代仪器分析技术发展后，应用四大谱对染料结构进行鉴定不仅结果准确可靠，其效率也大有提高［2，3］。目前，染料的分离分析方法有薄层色谱法［4］、高效液相色谱法［5］、毛细管电泳法［6］、固相萃取-高效液相色谱法［7］、高效液相色谱-柱后在线衍生荧光检测法［8］、高效液相色谱-串联质谱法［9-12］等。这些方法对于分离制备和微量检测很有助益，所涉及的领域包括食品、化妆品、刑事侦查、医学和环境等多个方面，而很少涉足染料合成和生产中的结构鉴定。另外，某些特定的染料经过复配具有增效的性能，一些商品活性染料常常由多组分的染料拼混而成，这给其结构鉴定带来了较大的难度。由于可以同时完成化合物的分离和给出各组分的部分结构信息，液相色谱-二极管阵列检测／质谱（HPLC-DAD／MS）联用在染料结构鉴定中具有特殊的优越性。

1 活性染料的结构特点

活性染料的结构可分为发色体（又称母体，chromophore）和活性基（reactive group，RG）两部分。在染色条件下能与纤维反应呈共价键结合的活性基是区别于其他类染料的特征结构。在活性染料开发的初期，各大染料公司曾开发了数十种活性基；但在发展过程中，或因其反应性能过于活泼或过于稳定，或因其成本或合成繁杂等原因，经过优胜劣汰，目前市场上常见的活性基有6 种，按其反应机理划分主要有亲核取代型和亲核加成型两大类［13］。

亲核取代型活性基主要是卤代杂环类，如一氯三嗪（MCT）、二氯三嗪（DCT）、氟三嗪（FCT）和氟氯嘧啶（FCP）衍生物。亲核加成型活性基主要有乙基砜硫酸酯（SES）和溴代丙烯酰胺（BAA）衍生物。近30 年发展的主要是多个活性基的组合，其目的在于提高固色率，其中包括同种活性基的组合和异种活性基的组合，这是当前活性染料发展的一个方向。

发色体的作用主要是赋予染料发色性能及染料对纤维的亲和力。按照染料的颜色划分，目前市场上流行的商品活性染料发色体大致可以归纳为表1所示的类别。

表1 市场上流行的商品活性染料发色体主要骨架结构Table 1 Main skeletons of popular commercial reactive dyes in markets

表1 （续）Table 1 （Continued）

表1 （续）Table 1 （Continued）

表1 中的结构通式涵盖了绝大部分市售商品活性染料的结构，而绿、棕色等在色度学中属于二次色，多由三原色中几种染料拼混而成，故未在表1 中列出。表1 所列母体的骨架结构以及上述常用的活性染料活性基类型可作为未知结构染料鉴定时的参考。

2 HPLC-DAD／MS 在鉴定未知结构活性染料中的应用

HPLC 是分析化学中的重要分离分析方法，其中反相离子对色谱兼具反相色谱和离子色谱的特点［14］，因而在有机酸［15］和有机碱［16］以及无机离子［17］的分析中得到广泛应用。活性染料结构中常常带有多个磺酸基，非常适合采用反相离子对色谱法进行分离。离子对色谱的理论模型有3 种:离子对保留机理［18］、动态离子交换模型和离子作用模型［19］。色谱工作者经过长期深入的研究，发现离子对色谱保留机理非常复杂，上述3 种理论模型都能在离子对色谱行为中得以反映［14］。为了便于质谱检测，离子对试剂必须具有挥发性，可选择的离子对试剂有叔胺［20，21］、铵盐［22］和含氟羧酸［16］等，其中醋酸三丁胺的效果较好，适合多磺酸基染料的分离。流动相常用甲醇-水或乙腈-水体系。

电喷雾质谱适合分析极性和中等极性化合物，其显著的特点是可形成多电荷离子，因此有利于多磺酸基活性染料的分析。采用HPLC-DAD／MS 联用技术，一次进样分析就可以同时获得HPLC 分离后各峰的吸收光谱图、色谱峰对应的相对分子质量以及分子的部分结构信息。针对活性染料这一特定研究对象，运用HPLC-DAD／MS 分析可获得以下信息。

2.1 初步判断染料水溶性基团的数目

活性染料分子中含有磺酸基或羧基等水溶性基团，它们在溶液中能去质子形成负离子［M-xH］x-，在电喷雾质谱中可得到［M-（x ＋y）H ＋yNa］x-。通过对染料分子碱金属加合物质荷比峰的解析可以判断该染料分子可能解离的最大电荷数，从而推断染料分子中有多少可解离基团［23］。如果实验中以醋酸三乙胺或醋酸三丁胺作为离子对试剂，在质谱中还能观察到醋酸根、三乙胺或三丁胺的加合峰，也可用于辅助判断电荷价态。但当染料结构中含有较多的磺酸基时，较难直接观察到其最大电荷价态。

2.2 初步判断具有A ＋2 稳定同位素的元素个数

很多活性染料分子的活性基或发色体中，常含有氯、溴、铜等元素，它们是A ＋2 同位素，并具有明显的同位素丰度比，如35Cl∶37Cl 丰度比大致为3 ∶1，79Br∶81Br 丰度比大致为1∶1，63Cu∶65Cu 丰度比接近于2∶1。HPLC-MS 联用分析可根据其同位素峰的丰度比大致判断染料分子中是否含有此类原子及所含个数。

2.3 初步推断染料活性基类别

活性染料的活性基在染料合成和贮存过程中可能会产生活性基水解物。如亲核取代型卤代杂环活性基的卤素原子被羟基取代，主染料与水解副染料的质量数之差应为该卤素原子与羟基的质量数之差；乙基砜硫酸酯在合成或贮存过程产生的副染料为其相应的乙烯砜以及乙烯砜与水的加成物羟乙基砜，其与主染料质量数之差依次应为98 和80。根据该差值可以初步推断未知染料的活性基类别。

2.4 结合衍生物质量差值法确定活性基类别

结合衍生物质量差值法确定活性基类别的方法为张蓉［24］创建。根据活性染料能与亲核试剂反应的特点，以乙醇胺或二乙醇胺与活性染料反应制得其衍生物，利用其反应前后质量数之差（ΔM）来确定其活性基类别（简称衍生物质量差值法）。如MCT 型染料与乙醇胺反应后，氯被β-羟乙基氨基取代，相对分子质量增加25；SES 型染料与乙醇胺反应，乙基砜硫酸酯先转化成乙烯砜再与乙醇胺加成，相对分子质量减少37。多活性基染料反应前后的ΔM 应为各活性基反应前后ΔM 值的代数和（ΣΔM）。张蓉［24］曾用该法确定了近百个活性染料的活性基，证明了方法的正确和可行性。

2.5 区分同分异构体

HPLC 可以分离同分异构体，并且可以通过异构体光谱的差别进行定性判断。近年活性染料发展的趋势是通过适当的染料拼混以达到增效的目的。例如通过三原色拼混得到的黑色染料，其提升力就高于三原色中任何一个单色组分［25，26］。对于混合组分中的同分异构体，经HPLC 分离后采用DAD识别其光谱就可以定性。

3 HPLC-DAD／MS 联用分析用于染料结构鉴定的实例

本文选取3 种商品活性染料为例详细说明HPLC-MS 联用技术在活性染料分析中的应用。

3.1 海洋蓝B 组分结构的鉴定

海洋蓝染料是近年推出的艳蓝色活性染料商品，HPLC-DAD／MS 分析表明其主要有两组化合物，在质谱总离子流图中，37 ～40 min 处为其中A组分的信号，而20 ～25 min 处则为B 组分的信号（见图1）。

图1 海洋蓝的（a）HPLC-DAD 和（b）质谱总离子流图Fig.1 （a）HPLC-DAD chromatogram and （b）MS total ion current chromatogram of Reactive Marine Blue

A 组分的保留时间为37.4 min，质谱测得其质量数为582，含两个可解离基团（磺酸基、羧基或是硫酸酯基）。电喷雾质谱检测可知A 组分具有中性丢失98 和80 的源内碰撞诱导解离（CID）碎片离子，表明为乙基砜硫酸酯活性基。根据其红光艳蓝的色光可以判断为应用极广的C. I.活性蓝19。经商品活性蓝19 与其混合样的HPLC-DAD／MS 测定证明无误。

在20 ～25 min 的B 组分出现3 个峰，保留时间依次为20.4 min（B-1）、22.4 min（B-2）和24.4 min（B-3）。3 个化合物的光谱很接近（见图2），最大吸收波长都在620 nm 左右，为同系物，其相应的质谱图如图3 所示。图3 提供了B-1、B-2 和B-3 的质量数依次为950、986、1 022 的信息。B-1 和B-2 质量数之差为36，B-2 和B-3 质量数之差也为36。其同位素A 和A ＋2 的丰度比大致为:B-1 为100∶85；B-2 为88∶100；B-3 为73∶100。由此可推断B 组分染料结构中含两个或两个以上氯原子，B-1、B-2 和B-3结构中依次多一个氯原子。

图2 海洋蓝B-1、B-2 和B-3 组分的紫外-可见光谱图Fig.2 UV-Vis spectra of components B-1，B-2 and B-3 of Reactive Marine Blue

从吸收光谱分析，其最大吸收波长都在620 nm，为绿光蓝色。吸收曲线的半波宽度较窄，染料色光应较明艳。结合质谱信息推断，该组染料可能是以三苯二恶嗪为母体，以乙烯砜和氯乙基砜为活性基组成的染料。专利［27］中，例8 记载了如图4 所示结构a 的染料，则B-2、B-3 应分别为结构b 和c。

B-1、B-2 和B-3 的结构信息与上述结构相符，并且该专利指出该染料适于和C. I. 活性蓝19 复配。经合成确证，B-1、B-2 和B-3 分别对应上述结构无误。

图3 海洋蓝B-1、B-2 和B-3 组分的质谱图Fig.3 Mass spectra of components B-1，B-2 and B-3 of Reactive Marine Blue

图4 海洋蓝B 组分的分子结构［27］Fig.4 Structure of component B of Reactive Marine Blue［27］

3.2 衍生物质量差值法确定活性灰中B 组分的活性基

本世纪初问世的活性灰为一拼混染料，其中B组分为一多活性基染料。在HPLC 分离出该组分后，质谱测得其质量数为1 271。为确定其活性基种类，用乙醇胺衍生化，经HPLC-DAD／MS 分析，其衍生物的质谱中主产物的质量数为1 398。衍生化前后的质谱信息见表2。B 组分衍生化前后的ΔM ＝127。组分B 应含1 个氯三嗪、1 个氟三嗪和1 个乙烯砜活性基。专利［28］记载其相应的染料活性基为图5 所述结构，证明通过HPLC-DAD／MS 联用衍生物质量差值法给出的活性基信息正确。

表2 活性灰B 组分衍生化前后的质谱解析Table 2 MS spectral analysis of ingredient B of Reactive Gray and its derivatives

图5 活性灰B 组分部分结构［28］Fig.5 Part of the structure of ingredient B of Reactive Gray［28］

3.3 拼混染料活性深黑中红色和藏青色同分异构体的分离和鉴定

活性深黑是上世纪开发的黑度高、牢度好的优秀品种，其HPLC-DAD／MS 分析谱图见图6。

活性深黑商品染料分离后可以得到3 组有色组分:黄色、藏青色和红色。其中藏青色组分与红色组分是质量数为903、有4 个可解离基团但吸收光谱不同的同分异构体（见表3）。这两个组分均可检出其［M-98］的乙烯砜或［M-80］的水解物羟乙基砜，其中红色组分还可检出［M-98-98］的双乙烯砜，说明具有两个乙基砜硫酸酯活性基。藏青色和红色组分的光谱图见图7。

图6 活性深黑的（a）HPLC-DAD 和（b）质谱总离子流图Fig.6 （a）HPLC-DAD chromatogram and （b）MS total ion current chromatogram of Reactive Supra Black

图7 活性深黑红色组分和藏青色组分紫外-可见光谱图Fig.7 UV-Vis spectra of red and navy components of Reactive Supra Black

图7 中最大吸收波长为600 nm 的是藏青色组分的光谱图。结合其质谱图解析可知，该藏青组分染料是已在各种品牌的活性黑中沿用了数十年、为染料业界熟知的C. I.活性黑5，其结构见图8。红色组分则是其同分异构体。

从染料结构设计出发，考虑到合成和中间体的供应等因素，既符合质谱行为，光谱又在黄光红色范围内的C. I.活性黑5 的同分异构体可能有如图8 所示的两种结构。按照近代发色理论分析，磺酸基处于偶氮体一侧应使光谱红移，前者的最高吸收应略处于长波区。经过合成确证，结构1 的最大吸收波长为505 nm，结构2 的最大吸收波长为490 nm。故可确定红色组分应为结构1。专利及文献［29-32］记载的红色组分也为结构1。

表3 活性深黑红色组分和藏青色组分的HPLC-DAD／MS 分析结果Table 3 HPLC-DAD／MS analysis of red and navy components of Reactive Supra Black

图8 C. I.活性黑5 及两种同分异构体的结构Fig.8 Structures of C. I. Reactive 5 and its two isomerides

4 结论

相比活性染料传统的分离分析和结构鉴定方法，HPLC-DAD／MS 联用分析技术的优点主要体现在如下3 点。

第一，该分析技术具有省时高效的优点。染料混合物一次进样就能实现多组分高效分离，分离的同时还能对每个组分进行光谱和质谱的在线检测，大大缩短了分析时间。

第二，所得分析结果信息丰富。DAD 能在190～700 nm 范围内进行全波长扫描，给出染料的吸收光谱图，结合行业经验可以判断染料分子的发色体结构，从而判断各个色谱峰的结构相似性和同源性。

第三，电喷雾质谱可以确定染料分子的质量数和水溶性基团的数目，对具有A ＋2 同位素的原子个数也可以初步判断，结合衍生物质量差值法还可以确定染料活性基的类型和数目。这些结构信息对于活性染料的结构分析都是非常关键的。

当然，任何一种分析技术都不能解决结构分析的全部内容，HPLC-DAD／MS 分析技术也是如此。其还必须结合专利查证和合成确证才能最终判断染料分子的结构。

［1］ China Dyestuff Industry Association. China Association Communication （中国染料工业协会. 中国染协通讯），2014（4）:5

［2］ Yang J Z. Analysis of Dyestuff. Beijing:Chemical Industry Press （杨锦宗. 染料分析与剖析. 北京:化学工业出版社），1997

［3］ Vankataraman K. The Analytical Chemistry of Synthetic Dyes.New York:John Wiley ＆Sun，1977

［4］ Zhao P C，Wang Y J，Cui L，et al. Chinese Journal of Chromatography （赵鹏程，王彦吉，崔岚，等. 色谱），2001，19（4）:382

［5］ Lang W，Sirisansaneeyakul S，Martins L O，et al. J Environ Manage，2014，132:155

［6］ Enaud E，Trovaslet M，Bruyneel F，et al. Dyes Pigments，2010，85:99

［7］ Zhu H，Huang K Y，Fu J F，et al. Chinese Journal of Chromatography （朱浩，黄坤玉，付建飞，等. 色谱），2014，32（3）:224

［8］ Liu J，Gong Z B. Chinese Journal of Chromatography（刘珺，弓振斌. 色谱），2012，30（6）:624

［9］ Zhu N W，Gu L，Yuan H P，et al. Water Res，2012，46:3859

［10］ Hou X L，Wu Y L，Yang T，et al. J Chromatogr B，2013，929:107

［11］ Zhang S F，Lin Z Z，Chen X Z，et al. Journal of Instrumental Analysis （张水锋，林珍珍，陈小珍，等. 分析测试学报），2012，31（10）:1229

［12］ Lin W X，Sun X Q，Zhao X R，et al. Chinese Journal of Chromatography （林维宣，孙兴权，赵雪蓉，等. 色谱），2012，30（5）:527

［13］ Chen R Q. Dyestuffs and Coloration （陈荣圻. 染料与染色），2014，51（2）:14

［14］ Zou H F，Zhang Y K，Lu P Z. Ion-pair High Performance Liquid Chromatography. Zhengzhou:Henan Science Press （邹汉法，张玉奎，卢佩章. 离子对高效液相色谱法. 郑州:河南科学技术出版社），1996

［15］ Kucharska A，Grabka J. Talanta，2010，80:1045

［16］ Yamamoto E，Ishihama Y，Asakawa N. Talanta，2014，127:219

［17］ Khan S S，Riaz M. Talanta，2014，122:209

［18］ Horvath C，Melander W，Molnar I，et al. Anal Chem，1977，49:2295

［19］ Stranaban J J，Deming S N. Anal Chem，1982，54:2251

［20］ Michopoulos F，Whalley N，Theodoridis G，et al. J Chromatogr A，2014，1349:60

［21］ Biba M，Welch C J，Foley J P. J Pharm Biomed Anal，2014，96:54

［22］ Li B，Zhou X Z，Li J Y，et al. J Chromatogr B，2014，969:12

［23］ Smyth W F，McClean S，O′Kane E，et al. J Chromatogr A，1999，854:259

［24］ Zhang R. ［PhD Dissertation］. Dalian:Dalian University of Technology （张蓉. ［博士学位论文］. 大连:大连理工大学），2009

［25］ Wu Z W，Wang Z，Zhang Z D. Chemical Industry and Engineering Progress （吴祖望，王专，张志达. 化工进展），2009，28（5）:874

［26］ Wu Z W，Yang W. Dyestuffs and Coloration （吴祖望，杨威.染料与染色），2007，44（1）:1

［27］ Athanassios T，Thomas V，Georg R. WO Patent. WO2009-053238，2009-04-30

［28］ Marie S J，Athanassios T. US Patent. US20080256726，2005-11-29

［29］ Athanassios T，Herbert K. US Patent. US6537332，1998-07-27

［30］ Wu Z W，Wang Z，Feng B C，et al. China Patent （吴祖望，王专，冯柏成，等. 中国专利），CN200610047488.9，2007-02-14

［31］ Wang Z，Wu Z W. Color Technol，2009，123:216

［32］ Wang Z，Wu Z W. Text Res，2010，80（5）:448