HPLC法同时测定白花蛇舌草中对香豆酸和熊果酸的含量*

黄祝刚，于亮，左琳，满其倩，容蓉，巩丽丽，蒋海强，吕青涛

(山东中医药大学，济南 250355)

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd)的干燥全草。近代研究发现，白花蛇舌草具有抗肿瘤、提高机体免疫功能、抗衰老、抗氧化、保肝利胆、抗化学诱变等作用［1–3］，其中主要的化合物有蒽醌类、烷烃类、萜类、有机酸类、生物碱类、挥发油类、黄酮类、多糖类、甾醇类、氨基酸以及一些微量元素等［4–6］。笔者在对白花蛇舌草乙酸乙酯部位进行抗子宫内膜癌活性研究时，通过活性筛选分离得到了对香豆酸和熊果酸两种成分。经文献检索发现，对香豆酸具有抗癌和抗心血管病的作用［7–8］；熊果酸具有多方面的药理作用，它对体外革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌均有活性，还有抗溃疡、镇咳、抗癌作用，可以抗突变、抗氧化、抗血管瘤生成和诱导癌细胞的分化［9］。为考察药材中对香豆酸和熊果酸的含量及其与抗癌作用的关系，笔者首次建立了HPLC法同时测定白花蛇舌草中对香豆酸和熊果酸含量的方法，并对7批白花蛇舌草药材中对香豆酸和熊果酸的含量进行了测定及对比，也为白花蛇舌草药材活性成分含量测定提供了参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1100型，附带DAD检测器、四元泵、自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机，美国安捷伦公司；

电子天平：AE240型，瑞士梅特勒公司；

对香豆酸、熊果酸化学对照品：批号分别为D–032–140728，X–006–140801–2，经HPLC检测对香豆酸和熊果酸纯度均在98%以上，北京宝赛希望生物科技有限公司；

白花蛇舌草药材：济南市漱玉平民大药房、七星大药房和康之源大药房等(产地及批号分别为江西111201，130301，130612；安徽130906；广西120908，130911；湖北120618)，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为茜草科草本植物白花蛇舌草；

甲醇：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

无水乙醇：分析纯，天津市达森化工产品销售有限公司；

实验用水为纯净水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Eclipse SB–C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.05%甲酸水溶液(A)–甲醇(B)，流 量 为1 mL／min；梯 度 洗 脱：0～20 min B为30%～45%，20～21 min B为45%～88%，21～45 min B为88%；柱温：30℃；检测波长：310 nm(对香豆酸)，210 nm(熊果酸)；进样体积：20 μL。

1.3 对照品溶液的制备

称取对香豆酸标准品适量，精密称定，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成0.035 8 mg／mL的对香豆酸溶液；称取熊果酸标准品适量，精密称定，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成0.426 mg／mL的熊果酸溶液。

1.4 样品溶液的制备

称取白花蛇舌草粉末(0.84～0.42 mm)约1 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇溶液80 mL，95℃水浴回流提取2.0 h，共提取3次，滤过，合并滤液，减压干燥蒸干，以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，制得样品溶液。

1.5 色谱图

在1.2色谱条件下对混合对照品溶液及样品溶液进行测定，色谱图见图1。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂选择

以对香豆酸与熊果酸的含量为指标，进行了白花蛇舌草的提取溶剂考察，比较了一系列不同浓度的乙醇提取物中二者的含量差异，最终选择70%乙醇对二者同时提取较为适宜。

图1 310 nm波长下混合对照品溶液色谱图

图2 310 nm波长下样品溶液色谱图

图3 210 nm波长下混合对照品溶液色谱图

图4 210 nm波长下样品溶液色谱图

2.2 检测波长考察

采用DAD检测器在190～400 nm波长下进行全波长扫描，采集光谱图，结果发现对香豆酸和熊果酸分别在310 nm处和210 nm处有最大吸收，故分别选择310 nm和210 nm作为对香豆酸和熊果酸的检测波长。当采用DAD检测器时，可以同时采集多个波长下的色谱图，因此可以一次完成两个组分不同波长下的同时检测。当采用普通紫外检测器时，可以在工作站软件中设置波长时间表，在两组分的出峰时间分别采用不同波长检测，实现两个组分不同波长下的同时测定。

2.3 流动相选择

首先采用等度洗脱的方式，结果发现目标成分很难与干扰峰有效分离，而采用梯度洗脱的方式，可以对对香豆酸和熊果酸达到很好的分离，并且在较短时间内同时出峰。但是采用梯度洗脱的方式时，条件控制不好会导致重现性差，解决办法是延长每次进样前的平衡时间，且每次采用相同的条件平衡色谱柱，这样会达到很好的分离效果。实验过程中比较了乙腈–水、乙腈–0.05%甲酸、甲醇–水、甲醇–2%冰乙酸、甲醇–0.05%甲酸5种流动相系统，结果发现采用甲醇–0.05%甲酸溶液梯度洗脱时，对香豆酸和熊果酸二者分离度均在1.5以上，各指标峰峰形良好，基线平稳，分离度高。

2.4 线性方程

精密量取对香豆酸和熊果酸对照品储备液0.5，1，2，4，6，8 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至标线，摇匀，按2.1项下色谱条件测定各峰面积。以峰面积为纵坐标、对香豆酸和熊果酸的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得对香豆酸线性回归方程为y=20 530x–37.56(r=0.999 8)；熊果酸线性回归方程为y=8 321x+12.81(r=0.999 6)。结果表明，对香豆酸在0.001 79～0.028 64 mg／mL、熊果酸在0.021 3～0.340 8 mg／mL时，对香豆酸和熊果酸的质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取同一份样品溶液，按2.1项下色谱条件，连续测定6次，结果见表1。由表1可知，对香豆酸和熊果酸测定结果的相对标准偏差分别为0.37%和0.32%，说明该方法精密度良好。

表1 白花蛇舌草中对香豆酸和熊果酸的精密度试验(n=6)

2.6 稳定性试验

取同一份样品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h进样分析，对香豆酸和熊果酸峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.4%和1.1%，表明样品在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号白花蛇舌草(0.84～0.42 mm)约1 g，精密称定6份，按1.4方法制备样品溶液，在1.2色谱条件下测定，测得药材中对香豆酸和熊果酸的平均含量分别为0.021%和0.307%，测定结果的相对标准偏差分别为1.5%和1.8%，说明该方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量同一批号的白花蛇舌草粉末(0.84～0.42 mm)1 g，精密称量6份，分别精密加入对香豆酸和熊果酸对照品溶液，按实验方法测定，结果见表2。由表2可知，对香豆酸和熊果酸的平均回收率分别为98.59%和98.23%，测定结果的相对标准偏差分别为0.81%和0.94%，表明方法具有较高的准确度。

表2 对香豆酸和熊果酸的加标回收试验结果(n=6)

2.9 样品测定

取7批白花蛇舌草粉末各3份，每份1 g，精密称定，按1.4方法制备样品溶液，在1.2色谱条件下测定对香豆酸和熊果酸的色谱峰面积，计算样品中二者的含量，结果见表3。由表3可知，不同产地及批号的白花蛇舌草中二者的差异较大，其中江西产地的白花蛇舌草二者含量均最高，而广西产地的药材二者含量均最少。

表3 白花蛇舌草药材中对香豆酸和熊果酸的含量测定结果(n =3)

3 结语

建立了HPLC法同时测定白花蛇舌草中对香豆酸和熊果酸两种化合物含量的方法，该方法具有较高的准确度和良好的精密度，为白花蛇舌草药材活性成分含量测定奠定了实验基础。结果表明不同产地及批号的白花蛇舌草中对香豆酸和熊果酸含量的差异较大，其中江西产白花蛇舌草中的对香豆酸及熊果酸含量均较高，所以对白花蛇舌草乙酸乙酯部位进行抗子宫内膜癌活性研究时，宜采用江西产的药材。

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