忍冬叶有效成分含量与气候因子的灰色关联分析

王玲娜+刘红燕+李佳+张永清

摘 要：采用HPLC法同时测定不同产区忍冬叶中8种有效成分（6种绿原酸类和2种黄酮类）的含量，并进行显著性分析；采用GTMS 3.0系统软件分析忍冬叶有效成分的含量与气候因子间的灰色关联度。结果表明：不同产区忍冬叶有效成分含量差异显著，山东产区忍冬叶质量最佳，其次为河北、河南；日照时数、降雨量、相对湿度是影响忍冬叶有效成分含量的主导气候因子。

关键词：忍冬叶；有效成分；气候因子；灰色关联度

中图分类号：S567.7+90.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0057-05

忍冬叶源于忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥叶，具清热解毒、凉散风热之功效[1]。随着对忍冬叶药理、活性成分研究的不断深入[2～6]，影响忍冬叶质量的因素受到了广泛关注。植物的次生代谢产物及其含量是评价药材品质的重要指标，其合成和积累除受自身遗传特性决定外，很大程度上受生长环境、气候、土壤等生态因素的直接或间接影响[7，8]，因此深入探讨环境因子对药用植物次生代谢产物的影响，对于提高药材质量及药用植物生产规范化、现代化、规模化具有重要意义。本试验采用HPLC法同时测定不同产区忍冬叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 8种有效成分的含量，并对其进行了差异性分析；同时，采用GTMS 3.0系统软件对忍冬叶有效成分的含量与气候因子间的关联度进行了分析，以期为忍冬叶多成分内控质量奠定基础，并进一步阐释影响不同产区忍冬叶活性成分含量的主导气候因子。

1 材料与方法

1.1 供试材料

忍冬叶于2013年7～8月份采集于山东、河南、河北等种植基地，样品采集后统一以硅胶干燥，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定，确认均为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥叶；不同产区相应的气候资料来自2012～2013年的《中国地面气候资料》（中国气象局内部资料）。

1.2 仪器与试剂

安捷伦1260高效液相色谱仪（包括G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、G1316A柱温箱和Agilent ChemStation 工作站）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器）；超声仪（KQ-500DE型）。

芦丁（100080-200306）对照品购于中国药品生物制品检定所；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C（批号分别为：PA0819RA13、20130415、ZS0922BA13、20130521、20131021、20130816、20130924）对照品均由上海源叶生物科技有限公司提供。

乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：ZORBAXSB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；柱温30℃；进样量：20 μL；检测波长为325、350 nm。流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；洗脱程序如下：0～10 min，A相92%～90%，B相8%～10%；10～20 min，A相90%～85%，B相10%～15%；20～30 min，A相85%，B相15%；30～40 min，A相85%～75%，B相15%～25%；40～60 min，A相75%～0，B相25%～100%。

1.3.2 对照品溶液制备 称取适量新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品，用50%的甲醇配制成单个对照品储备液，分别量取适量各储备液配制成系列浓度的混合对照品。

1.3.3 供试品溶液制备 称取忍冬叶粉末0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，密塞，称重，超声处理（功率100 W，频率100 Hz）30 min，放冷，50%甲醇溶液补重，过微孔滤膜，取续滤液，即得。

1.4 方法学考察

1.4.1 线性关系的考察 分别吸取不同体积新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 8种有效成分储备液，以50%甲醇稀释成不同质量浓度的系列溶液。按上述色谱条件测定，以对照品的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，见表1。

1.4.2 精密度试验 取1.3.3制备的样品溶液一份，连续进样6次，以峰面积计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的RSD分别为1.22%、2.38%、1.10%、2.34%、1.12%、2.10%、1.67%、1.13%，表明该方法精密度良好。

1.4.3 稳定性试验 取1.3.3制备的样品溶液一份，分别于0、2、4、6、16、24 h后进样分析，结果显示，在该色谱条件下，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的稳定性分别为2.22%、2.34%、1.78%、2.13%、0.98%、1.45%、2.55%、3.01%，表明在24 h内，有效成分溶液是稳定的。

1.4.4 重复性试验 称取6份同一产地忍冬叶样品各0.5 g，按1.3.3方法制备供试品溶液。结果显示，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的RSD分别为3.0%、1.6%、3.7%、2.3%、3.2%、3.3%、3.2%、3.0%，表明该方法重复性良好。

1.4.5 加标回收率试验 称取6份已知含量的样品各0.5 g，加入适量新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备溶液并测定，计算平均回收率为99.47%～102.10%，RSD为0.61%～2.28% ，表明该方法回收率良好（表2）。endprint

1.5 样品含量测定

本试验选取3个省份共9个产区忍冬叶样品，按照1.3.3方法制备供试品液，记录色谱峰面积，分别代入回归方程，计算不同产区8种有效成分的含量，并进行单因素方差分析。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0系统软件进行不同产区忍冬叶中有效成分含量的单因素方差分析；采用GTMS 3.0系统软件进行不同产区忍冬叶有效成分含量与气候因子之间的灰色关联分析。

2 结果与分析

2.1 混合对照品与样品的色谱图

在1.3.1色谱条件下，所得混合对照品（A）与样品（B）的色谱图如图1所示。

2.2 样品含量的测定

由表3可知，不同省份的忍冬叶8种有效成分含量差异极显著，同一省份不同产区间含量差异较小。山东各产区新绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A的含量均高于河北、河南产区，且隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C含量总体较好，说明山东产区忍冬叶有效成分含量均较高且稳定性好，忍冬叶药材质量较高。河南产区绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A及异绿原酸C含量变异较大，分析可能与当地栽培管理模式有关；河北产区芦丁、木犀草苷、异绿原酸C含量最低，但总体来看各有效成分含量变化较河南产区稳定。

2.3 气候因子与忍冬叶8种有效成分含量的灰色关联度

分别以9个产区忍冬叶的8种有效成分含量数据作参考序列x0（k），以所在地的6个主要气候因子分别作为比较序列x1（k）、x2（k）、x3（k）、x4（k）、x5（k）、x6（k），计算8种有效成分的含量与各气候因子的灰色关联度。

由表4可知，影响新绿原酸含量的主要气候因子是降雨量（r=0.8818）；影响绿原酸含量的主要气候因子是日照时数（r=0.9572）、相对湿度（r=0.8546）；影响隐绿原酸含量的主要气候因子是相对湿度（r=0.9711）、最高温度（r=0.8801），其次是平均温度和日照时数；影响芦丁含量的主要气候因子是降雨量（r=0.8815）；影响木犀草苷含量的主要气候因子是日照时数（r=0.8677）和降雨量（r=0.8666）；影响异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C含量的主要气候因子均是降雨量和日照时数。综上所述，6个气候因子中，日照时数、降雨量、相对湿度对忍冬叶有效成分含量影响较大。

3 结论与讨论

忍冬叶中化学成分含量与气候因子之间关系密切，但由于地理现象与问题的复杂以及人们认识水平的限制，得到的信息常带有某种不确定性，许多因素之间的关系很难用简单的统计方法分析界定。在灰色关联分析中，将众多因子视为灰色系统，各因子的重要性以关联度排序表示，关联度大，表示该指标重要，克服了以往对因子进行评判的主观性和粗放性，能够充分揭示各环境因子对忍冬叶活性成分的重要性[6，9]。

单因素方差分析结果显示，不同省份间忍冬叶有效成分含量差异极为显著，说明环境因子对忍冬叶有效成分的合成影响较大。山东、河南、河北三大省区相比较，山东产区忍冬叶有效成分含量最高，质量较佳；其次为河北、河南。三大省区内所采集样品地理位置较为接近，气候因子一致，但样品间部分有效成分含量有所差异，说明除环境因子外，栽培品种、人工栽培管理模式等对忍冬叶有效成分的合成也有不同程度的影响。

灰色关联分析结果表明，忍冬叶的有效成分含量与气候因子密切相关，日照时数、降雨量及相对湿度是影响忍冬叶有效成分含量差异的主要气候因子，而温度并不是影响绿原酸（上接第60页）含量的重要因子，这与查菲娜等[10～12]对影响金银花中绿原酸含量的气候因子分析结果一致，各气候因子对忍冬叶有效成分影响的机理，还有待进一步研究。

参 考 文 献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：52，412-413.

[2] 管雪梅，郭庆梅，王秀凤，等.8个不同种质忍冬叶中绿原酸含量测定[J].山东中医药大学学报，2008，32（5）：410-412.

[3] 苟占平，万德光.6种忍冬叶中绿原酸及总咖啡酰奎宁酸含量测定[J].中药材，2008，31（3）：388-390.

[4] 时新刚，舒希凯，刘伟，等.HPLC法同时测定忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸含量[J].山东科学，2013，26（4）：20-23.

[5] 李瑞国.忍冬不同器官3种活性成分的测定[J].邢台学院学报，2011，26（4）：188-189.

[6] 邵莹，吴启南，乐巍，等.淡竹叶品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J]. 中国现代中药，2013，15（6）：476-481.

[7] 李彦，周晓东，楼浙辉，等.植物次生代谢产物及影响其积累的因素研究综述[J].江西林业科技，2012（3）：54-60.

[8] 曹海禄，曹国番，魏建和，等.遗传和环境因子对药用植物品质的影响[J].中草药，2007，38（5）：785-787.

[9] 李倩，梁宗锁，董娟娥，等. 丹参品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J]. 生态学报，2010，30（10）：2569-2575.

[10] 查菲娜，闫伟杰，陈金英，等.气象因素对金银花中绿原酸含量的影响[J].气象与环境科学，2008，31（S1）：166-168.

[11] 邢俊波，李萍，张重义.金银花质量与生态系统的相关性研究[J].中医药学刊，2003，21（8）：1237-1238.

[12] 张重义，李萍，陈君，等. 金银花道地与非道地产区土壤微量元素分析[J]. 中国中药杂志，2003，28（3）：18-24. 山 东 农 业 科 学 2014，46（11）：72～74，78endprint

1.5 样品含量测定

本试验选取3个省份共9个产区忍冬叶样品，按照1.3.3方法制备供试品液，记录色谱峰面积，分别代入回归方程，计算不同产区8种有效成分的含量，并进行单因素方差分析。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0系统软件进行不同产区忍冬叶中有效成分含量的单因素方差分析；采用GTMS 3.0系统软件进行不同产区忍冬叶有效成分含量与气候因子之间的灰色关联分析。

2 结果与分析

2.1 混合对照品与样品的色谱图

在1.3.1色谱条件下，所得混合对照品（A）与样品（B）的色谱图如图1所示。

2.2 样品含量的测定

由表3可知，不同省份的忍冬叶8种有效成分含量差异极显著，同一省份不同产区间含量差异较小。山东各产区新绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A的含量均高于河北、河南产区，且隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C含量总体较好，说明山东产区忍冬叶有效成分含量均较高且稳定性好，忍冬叶药材质量较高。河南产区绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A及异绿原酸C含量变异较大，分析可能与当地栽培管理模式有关；河北产区芦丁、木犀草苷、异绿原酸C含量最低，但总体来看各有效成分含量变化较河南产区稳定。

2.3 气候因子与忍冬叶8种有效成分含量的灰色关联度

分别以9个产区忍冬叶的8种有效成分含量数据作参考序列x0（k），以所在地的6个主要气候因子分别作为比较序列x1（k）、x2（k）、x3（k）、x4（k）、x5（k）、x6（k），计算8种有效成分的含量与各气候因子的灰色关联度。

由表4可知，影响新绿原酸含量的主要气候因子是降雨量（r=0.8818）；影响绿原酸含量的主要气候因子是日照时数（r=0.9572）、相对湿度（r=0.8546）；影响隐绿原酸含量的主要气候因子是相对湿度（r=0.9711）、最高温度（r=0.8801），其次是平均温度和日照时数；影响芦丁含量的主要气候因子是降雨量（r=0.8815）；影响木犀草苷含量的主要气候因子是日照时数（r=0.8677）和降雨量（r=0.8666）；影响异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C含量的主要气候因子均是降雨量和日照时数。综上所述，6个气候因子中，日照时数、降雨量、相对湿度对忍冬叶有效成分含量影响较大。

3 结论与讨论

忍冬叶中化学成分含量与气候因子之间关系密切，但由于地理现象与问题的复杂以及人们认识水平的限制，得到的信息常带有某种不确定性，许多因素之间的关系很难用简单的统计方法分析界定。在灰色关联分析中，将众多因子视为灰色系统，各因子的重要性以关联度排序表示，关联度大，表示该指标重要，克服了以往对因子进行评判的主观性和粗放性，能够充分揭示各环境因子对忍冬叶活性成分的重要性[6，9]。

单因素方差分析结果显示，不同省份间忍冬叶有效成分含量差异极为显著，说明环境因子对忍冬叶有效成分的合成影响较大。山东、河南、河北三大省区相比较，山东产区忍冬叶有效成分含量最高，质量较佳；其次为河北、河南。三大省区内所采集样品地理位置较为接近，气候因子一致，但样品间部分有效成分含量有所差异，说明除环境因子外，栽培品种、人工栽培管理模式等对忍冬叶有效成分的合成也有不同程度的影响。

灰色关联分析结果表明，忍冬叶的有效成分含量与气候因子密切相关，日照时数、降雨量及相对湿度是影响忍冬叶有效成分含量差异的主要气候因子，而温度并不是影响绿原酸（上接第60页）含量的重要因子，这与查菲娜等[10～12]对影响金银花中绿原酸含量的气候因子分析结果一致，各气候因子对忍冬叶有效成分影响的机理，还有待进一步研究。

参 考 文 献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：52，412-413.

[2] 管雪梅，郭庆梅，王秀凤，等.8个不同种质忍冬叶中绿原酸含量测定[J].山东中医药大学学报，2008，32（5）：410-412.

[3] 苟占平，万德光.6种忍冬叶中绿原酸及总咖啡酰奎宁酸含量测定[J].中药材，2008，31（3）：388-390.

[4] 时新刚，舒希凯，刘伟，等.HPLC法同时测定忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸含量[J].山东科学，2013，26（4）：20-23.

[5] 李瑞国.忍冬不同器官3种活性成分的测定[J].邢台学院学报，2011，26（4）：188-189.

[6] 邵莹，吴启南，乐巍，等.淡竹叶品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J]. 中国现代中药，2013，15（6）：476-481.

[7] 李彦，周晓东，楼浙辉，等.植物次生代谢产物及影响其积累的因素研究综述[J].江西林业科技，2012（3）：54-60.

[8] 曹海禄，曹国番，魏建和，等.遗传和环境因子对药用植物品质的影响[J].中草药，2007，38（5）：785-787.

[9] 李倩，梁宗锁，董娟娥，等. 丹参品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J]. 生态学报，2010，30（10）：2569-2575.

[10] 查菲娜，闫伟杰，陈金英，等.气象因素对金银花中绿原酸含量的影响[J].气象与环境科学，2008，31（S1）：166-168.

[11] 邢俊波，李萍，张重义.金银花质量与生态系统的相关性研究[J].中医药学刊，2003，21（8）：1237-1238.

[12] 张重义，李萍，陈君，等. 金银花道地与非道地产区土壤微量元素分析[J]. 中国中药杂志，2003，28（3）：18-24. 山 东 农 业 科 学 2014，46（11）：72～74，78endprint

1.5 样品含量测定

本试验选取3个省份共9个产区忍冬叶样品，按照1.3.3方法制备供试品液，记录色谱峰面积，分别代入回归方程，计算不同产区8种有效成分的含量，并进行单因素方差分析。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0系统软件进行不同产区忍冬叶中有效成分含量的单因素方差分析；采用GTMS 3.0系统软件进行不同产区忍冬叶有效成分含量与气候因子之间的灰色关联分析。

2 结果与分析

2.1 混合对照品与样品的色谱图

在1.3.1色谱条件下，所得混合对照品（A）与样品（B）的色谱图如图1所示。

2.2 样品含量的测定

由表3可知，不同省份的忍冬叶8种有效成分含量差异极显著，同一省份不同产区间含量差异较小。山东各产区新绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A的含量均高于河北、河南产区，且隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C含量总体较好，说明山东产区忍冬叶有效成分含量均较高且稳定性好，忍冬叶药材质量较高。河南产区绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A及异绿原酸C含量变异较大，分析可能与当地栽培管理模式有关；河北产区芦丁、木犀草苷、异绿原酸C含量最低，但总体来看各有效成分含量变化较河南产区稳定。

2.3 气候因子与忍冬叶8种有效成分含量的灰色关联度

分别以9个产区忍冬叶的8种有效成分含量数据作参考序列x0（k），以所在地的6个主要气候因子分别作为比较序列x1（k）、x2（k）、x3（k）、x4（k）、x5（k）、x6（k），计算8种有效成分的含量与各气候因子的灰色关联度。

由表4可知，影响新绿原酸含量的主要气候因子是降雨量（r=0.8818）；影响绿原酸含量的主要气候因子是日照时数（r=0.9572）、相对湿度（r=0.8546）；影响隐绿原酸含量的主要气候因子是相对湿度（r=0.9711）、最高温度（r=0.8801），其次是平均温度和日照时数；影响芦丁含量的主要气候因子是降雨量（r=0.8815）；影响木犀草苷含量的主要气候因子是日照时数（r=0.8677）和降雨量（r=0.8666）；影响异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C含量的主要气候因子均是降雨量和日照时数。综上所述，6个气候因子中，日照时数、降雨量、相对湿度对忍冬叶有效成分含量影响较大。

3 结论与讨论

忍冬叶中化学成分含量与气候因子之间关系密切，但由于地理现象与问题的复杂以及人们认识水平的限制，得到的信息常带有某种不确定性，许多因素之间的关系很难用简单的统计方法分析界定。在灰色关联分析中，将众多因子视为灰色系统，各因子的重要性以关联度排序表示，关联度大，表示该指标重要，克服了以往对因子进行评判的主观性和粗放性，能够充分揭示各环境因子对忍冬叶活性成分的重要性[6，9]。

单因素方差分析结果显示，不同省份间忍冬叶有效成分含量差异极为显著，说明环境因子对忍冬叶有效成分的合成影响较大。山东、河南、河北三大省区相比较，山东产区忍冬叶有效成分含量最高，质量较佳；其次为河北、河南。三大省区内所采集样品地理位置较为接近，气候因子一致，但样品间部分有效成分含量有所差异，说明除环境因子外，栽培品种、人工栽培管理模式等对忍冬叶有效成分的合成也有不同程度的影响。

灰色关联分析结果表明，忍冬叶的有效成分含量与气候因子密切相关，日照时数、降雨量及相对湿度是影响忍冬叶有效成分含量差异的主要气候因子，而温度并不是影响绿原酸（上接第60页）含量的重要因子，这与查菲娜等[10～12]对影响金银花中绿原酸含量的气候因子分析结果一致，各气候因子对忍冬叶有效成分影响的机理，还有待进一步研究。

参 考 文 献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：52，412-413.

[2] 管雪梅，郭庆梅，王秀凤，等.8个不同种质忍冬叶中绿原酸含量测定[J].山东中医药大学学报，2008，32（5）：410-412.

[3] 苟占平，万德光.6种忍冬叶中绿原酸及总咖啡酰奎宁酸含量测定[J].中药材，2008，31（3）：388-390.

[4] 时新刚，舒希凯，刘伟，等.HPLC法同时测定忍冬的花、叶中木犀草苷和绿原酸含量[J].山东科学，2013，26（4）：20-23.

[5] 李瑞国.忍冬不同器官3种活性成分的测定[J].邢台学院学报，2011，26（4）：188-189.

[6] 邵莹，吴启南，乐巍，等.淡竹叶品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J]. 中国现代中药，2013，15（6）：476-481.

[7] 李彦，周晓东，楼浙辉，等.植物次生代谢产物及影响其积累的因素研究综述[J].江西林业科技，2012（3）：54-60.

[8] 曹海禄，曹国番，魏建和，等.遗传和环境因子对药用植物品质的影响[J].中草药，2007，38（5）：785-787.

[9] 李倩，梁宗锁，董娟娥，等. 丹参品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J]. 生态学报，2010，30（10）：2569-2575.

[10] 查菲娜，闫伟杰，陈金英，等.气象因素对金银花中绿原酸含量的影响[J].气象与环境科学，2008，31（S1）：166-168.

[11] 邢俊波，李萍，张重义.金银花质量与生态系统的相关性研究[J].中医药学刊，2003，21（8）：1237-1238.

[12] 张重义，李萍，陈君，等. 金银花道地与非道地产区土壤微量元素分析[J]. 中国中药杂志，2003，28（3）：18-24. 山 东 农 业 科 学 2014，46（11）：72～74，78endprint