禽腺联病毒VP 基因在昆虫细胞中的表达

王安平， 朱善元， 吴 双， 王永娟， 左伟勇， 洪伟鸣

(江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏 泰州225300)

禽腺联病毒(Avian adeno-associated virus，AAAV)于1973 年由Yates 等［1］首次报道，AAAV 病毒粒子直径为20 ～25 nm，呈正二十面体对称，由3 个衣壳蛋白质构成，无包膜，基因组大小为4 700 bp，两端是末端反向重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)，中间部分含有2 个大的开放阅读框架及3 个启动子，分别编码结构基因Cap和非结构基因Rep。Cap基因的转录从p40 启动子开始，分别从主要的起始密码子AUG 和次要的起始密码子ACG 形成mRNA，然后再经过剪接形成3 个结构蛋白质VP1、VP2和VP3，在成熟毒粒中的比例大约为1 ∶1 ∶10。VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的，VP2 在病毒样空颗粒的装配中起重要作用，VP3 需要与VP1或VP2 一起完成核定位任务［2-3］。

目前禽类已经分离到2 种血清型腺联病毒并完成序列测定，Wang 等报道分离到1 株血清型禽腺联病毒并进行了测序［4］。江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室前期开展了利用三质粒制备rAAAV，并以此作为载体传递hKLK1 及miRNA，获得了长期高效的表达［5-6］，但是三质粒法制备rAAAV 滴度较低，限制了其进一步开发应用。Urabe 等［7］首次报道了利用杆状病毒与昆虫细胞系统制备rAAV，滴度高，且性质与传统三质粒法制备的rAAV 没有区别，但是目前还没有杆状病毒系统制备rAAAV 的研究。为研究在昆虫细胞中制备rAAAV，首先必须在昆虫细胞中成功表达其结构基因，本研究利用Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达3 个VP 蛋白质，为利用杆状病毒系统研制重组禽腺联病毒载体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、载体和菌株

Sf9 细胞、含AAAV 全基因组的重组质粒pCRAAAV、大肠杆菌DH5α 感受态细胞均由江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室提供;杆状病毒Bac-to-Bac 表达系统(包括转座质粒pFastBac1、E.coliDH10Bac 受体菌)购自Invitrogen 公司。

1.2 工具酶和试剂

pfuDNA Polymerase、限制性内切酶Hind Ⅲ、NotⅠ及T4DNA 连接酶购自Fermentas 公司;Wizard DNA Clean-up System 购自美国Promega 公司;昆虫细胞培养基Sf-900ⅡSFM (Serum free medium)购自GBICO公司;转染试剂CellfectinⅡReagent 购自Invitrogen 公司;HRP 标记的羊抗鼠IgG 购自康为世纪生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯级。

1.3 引物的设计与合成

参考GenBank 中登录的AAAV 的基因序列设计1 对引物扩增VP基因，在VP引物的上、下游5'端分别添加了NotI 和Hind Ⅲ酶切位点。通用引物M13F/M13R 参照Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统设计，引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。引物序列为:VP上游引物:5'-CATGCGGCCGCCACGGCTCTTATTTCTGACGCGATACCCGATTGGTTG-'3(下划线为NotI 酶切位点，斜体表示突变的位点)，VP下游引物:5'-CGTAAGCTTTTACAGCGGTTTGGTGAGGTAACGGGTACCG-' 3 (下划线为Hind Ⅲ酶切位点)。通用引物序列为:M13 上游引物:5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-'3，M13 下游引物:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-'3。

1.4 VP 基因的扩增

反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s ，72 ℃延伸2 min，反应进行30 个循环;72 ℃延伸10 min。PCR 产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳，按Wizard DNA Clean-up System 试剂盒说明书进行纯化回收目的基因，4 ℃保存备用。

1.5 重组转座载体pFastBac-VP 的构建

回收的VP基因经NotI 和Hind Ⅲ酶切后，与经同样酶切的pFastBac1 连接，在含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB 琼脂平板上37 ℃培养过夜后，挑取单菌落，提取质粒电泳筛选，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确后送由上海生工生物工程公司测序，鉴定正确的克隆命名为pFastBac-VP。

1.6 重组杆状病毒穿梭载体的构建

参考Invitrogen 公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression System 使用说明，将阳性重组质粒pFast-BacDual-Rep 转化DH10Bac 感受态细胞，用四环素(10 μg/ml)、卡那霉素(50 μg/ml)、庆大霉素(7 μg/ml)、IPTG(40 μg/ml)、X-gal(100 μg/ml)LB琼脂平板筛选白色阳性菌落，挑取白色菌落，提取质粒，用M13 上、下游引物进行PCR 鉴定，扩增条件如下:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，反应进行30 个循环;72 ℃再延伸10 min。产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，获得的阳性重组转座子命名为rBacmid-VP。

1.7 重组杆状病毒rBac-VP 的制备

将rBacmid-VP参照Cellfectin ⅡReagent 转染试剂说明书转染对数生长期Sf 9 昆虫细胞。转染后每隔12 h 观察1 次细胞，直至细胞出现明显的病变，收集上清液，500g离心5 min，将上清液转移至新的无菌管中，此即为P1 代rBac-VP，4 ℃保存备用。

1.8 VP 基因的表达与鉴定

将P1 代rBac-VP按感染复数(MOI)为0.1 感染对数生长期Sf9 细胞，直至细胞出现明显病变(感染后约48 ～72 h)，收集上清液即为P2 代重组病毒，按此方法将病毒传至P3 代。将P3 代rBac-VP分别按MOI 为1、5 和10 接种24 孔板中Sf9 细胞，分别在感染后24 h、48 h、72 h 收集细胞沉淀，PBS 洗涤一次后，于沉淀中加入100 μl 1×Loading buffer 煮沸3 min后，取15 μl 进行SDS-PAGE 分析，以未接种病毒的细胞沉淀作为阴性对照。样品电泳结束后转印PVDF膜，以鼠抗VP3 多抗作为一抗，以HRP 标记的羊抗鼠作为二抗，按常规方法进行Western blot 反应。

2 结果

2.1 VP 基因的扩增

以VP上、下游引物扩增VP基因，产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可见大约 2 200 bp 条带(图1)，与预期结果相符。

图1 目的基因的PCR 扩增结果Fig.1 Amplified products of target genes by PCR

2.2 重组转座载体pFastBac-VP 的构建与鉴定

VP基因回收后用SalI 和NotI 酶切，与经同样酶切的pFastBac1 连接，获得重组转座载体pFast-Bac-VP。经NotI 和Hind Ⅲ酶切出约2 200 bp和4 800 bp 2 条带(图2)，与预期相符，且DNA 测序证明VP基因克隆正确且无突变。

2.3 重组杆状病毒穿梭载体的鉴定

以构建的重组穿梭载体rBacmid-VP为模板，以M13 上、下游引物分别进行PCR 鉴定，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后在4 500 bp 处可见特异性条带，与预期片段大小相符(图3)，表明VP基因转座成功。

2.4 重组杆状病毒的收获及感染细胞的病变

rBacmid-VP转染对数生长期Sf9 细胞，5 d 后可见明显的细胞病变现象:细胞变大，细胞生长停止，细胞内出现颗粒，有些细胞肿大而破碎，而未转染组的细胞未出现此现象。

图2 重组质粒pFastBac-VP 的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pFastBac-VP by restriction endonucleases digestion

图3 重组转座子的PCR 鉴定Fig.3 Identification of recombinant transponson by PCR

2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析

将P3 代rBac-VP感染24 孔板中对数生长期的Sf9 细胞，细胞沉淀进行SDS-PAGE 分析，结果显示，在分子量约为87 000、73 000 和62 000 处分别出现3 条特异性条带，比例约为1 ∶1 ∶10(图4)。

2.6 重组蛋白质的Western blot 鉴定

重组蛋白质经SDS-PAGE 电泳后，采用鼠抗VP3 多抗为一抗进行Western blot 检测，结果在87 000、73 000 和62 000 处分别出现特异条带(图5)，分子量与目的蛋白质相同，而正常Sf9 细胞未出现相应条带，说明重组蛋白质在昆虫细胞中获得了成功表达，且具备良好的反应原性。

3 讨论

腺联病毒(Adeno-associated virus，AAV)又称腺病毒相关病毒，作为一种新型的病毒载体，具有对宿主没有致病性、免疫原性极低、宿主范围广等优点［8］，因此被认为是一种比较理想的基因转移载体，广泛地用于基因治疗和基因工程疫苗等方面的研究［9-12］。禽腺联病毒(Avian adeno-associated virus，AAAV)的理化性质、基因组结构等与AAV 基本相似，提示可作为有潜力的重组病毒载体开发应用。

图4 重组蛋白质的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

图5 重组蛋白质的Western blot 鉴定Fig.5 Western blot identification of recombinant protein

由于AAV 是一种复制缺陷型病毒，在制备rAAV 需要辅助质粒或者辅助病毒的帮助，且传统的制备方法滴度低、不能扩增，一直制约着rAAV 的基础与临床应用［13］。杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种常用的真核细胞表达系统，且杆状病毒同样可以像腺病毒或单纯疱疹病毒一样为AAV 的复制提供辅助，但不具有腺病毒和单纯疱疹病毒对人体的毒性，且病毒颗粒大，与AAV 病毒颗粒差异显著，便于rAAV 的分离纯化。因此利用杆状病毒与昆虫细胞系统制备rAAV 的研究也越来越多［14-15］，但是应用昆虫细胞系统制备rAAAV 的研究却还没有报道。

Cap基因编码AAAV 的3 个结构基因，通过内含子不同强弱的剪切信号及强弱起始密码子的选择翻译形成3 个结构蛋白质VP1、VP2 和VP3，在AAAV 成熟病毒粒子中3 个结构蛋白质的比例约为1 ∶1 ∶10。为研究利用昆虫细胞系统制备rAAAV，首先必须在昆虫细胞中表达出比例合适的3 个结构蛋白质，由于杆状病毒与昆虫细胞系统不一定能识别rAAAV 的内含子剪切信号，所以不能直接将含有剪切信号的Cap基因克隆于杆状病毒载体中。为了在杆状病毒系统中表达出比例合适的结构蛋白质，本试验将VP1起始密码子周围序列进行了突变，将VP1起始密码子ATG 突变为弱起始密码子ACG，并将其置于强Kozak 序列(ACCAUGG)中，并将其后的ATG 突变为ACG，同时将剪切信号序列突变掉。VP2起始密码子为弱起始密码子ACG，同样位于强Kozak 序列中，而VP3起始密码子为强起始密码子ATG。SDS-PAGE 及Western blot 结果表明3个结构蛋白质均获得了成功表达，分子量正确，具有良好的免疫活性，且比例与预期相符。

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