非标记适体-金纳米检测尿中痕量腺苷

赵慧，王爱芝，王永生

(南华大学 公共卫生学院，湖南 衡阳 421001)

研究表明，肿瘤细胞的快速增殖可导致腺嘌呤核苷酸降解，使腺苷的产生和排出增多，尿中腺苷可以作为潜在的肿瘤标志物［1-2］。因此，检测尿液中腺苷含量对恶性肿瘤早期诊断、预后监测等方面具有重要意义。

目前测定尿中痕量腺苷的方法有高效液相色谱法［3］、毛细管电泳法［4］、液相色谱-质谱联用法［5］、共振光散射法［6］、荧光分光光度法［7］等，这些方法虽然各有优点，但都存在或多或少的不足。

本文基于腺苷与未标记的腺苷适体特异性结合，金纳米不被腺苷适体保护而在高盐浓度下聚集，导致共振光散射增强的原理，建立RLS 测定腺苷的新方法，已用于尿样中腺苷的测定。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

腺苷、氯金酸、柠檬酸三钠、氯化钠等均为分析纯;腺苷适体为色谱纯(序列号为5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3'，临用前需95 ℃5 min处理后，缓慢冷却至室温);实验用水为灭菌双蒸水;金纳米，按参考文献［8］制备。

F-4500 荧光分光光度计;UV-2550 紫外-可见分光光度计;AB204-S 电子分析天平;PB-21 型精密酸度计。

1.2 实验方法

于2 mL EP 管中依次加入pH 4.6 BR 缓冲溶液35 μL，1.0 μmol/L 腺苷适体20 μL 和不同体积的1.0 ×10－10mol/L 腺苷溶液，漩涡混匀，于37 ℃恒温水浴箱中孵育30 min。加入金纳米粒子40 μL，加入适量灭菌双蒸水，混匀，室温孵育25 min。加入0.5 mol/L NaCl 溶液50 μL，混匀后立即在荧光分光光度计上以λex=λem进行同步扫描，获取RLS 光谱，记录λmax=540 nm 处溶液RLS 强度(I)和试剂空白RLS 强度(I0)，计算ΔI=I－I0。激发和发射狭缝宽度分别为5.0，10.0 nm，光电倍增管电压为400 V。同时在紫外-可见分光光度计上扫描吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 光谱特征

图1 为适体-AuNPs-腺苷体系的吸收光谱图和RLS 图谱。

图1 适体-AuNPs-腺苷体系的吸收光谱(1)和RLS 光谱(2)Fig.1 Absorption and RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

由图1 可知，适体-AuNPs-腺苷体系的最大RLS峰位于540 nm，处于体系的最大吸收峰附近。由于RLS 作用包括散射-吸收-再散射过程，根据Miller、Anglister 和Steinberg 的RLS 理论，体系增强的散射光谱可以认为是共振光散射。

图2 为适体-AuNPs-腺苷体系在pH 4.6 BR 缓冲液中的RLS 图谱。

由图2 可知，在pH 4.6 BR 缓冲液中，单独的AuNPs 的RLS 强度很弱(图2a)，加入NaCl 溶液之后，AuNPs 在高盐溶液中发生聚集，体系的RLS 强度显著增强(图2b)。在AuNPs 溶液中加入腺苷适体，再加入NaCl 后，AuNPs 被腺苷适体保护，体系的RLS 强度减弱(图2c)。在适体-AuNPs 复合物中加入腺苷，腺苷与腺苷适体特异性结合，金纳米不被腺苷适体保护而在高盐浓度下聚集，体系的RLS 强度增强(图2d)，且随着腺苷浓度增加，体系的RLS 依次增强，在λmax=540 nm 处，腺苷浓度与ΔI 在一定范围内呈良好线性关系。

图2 适体-AuNPs-腺苷体系的RLS 光谱Fig.2 RLS spectra of aptamer-AuNPs-adenosine system

2.2 实验条件的优化

2.2.1 体系酸度及用量的影响 选用PBS、MES 和BR 3 种缓冲溶液进行实验，结果表明，在BR 缓冲液中，体系的RLS 强度的变化值最大。在BR 缓冲液中，随着pH 增加，ΔI 值也不断的上升，在pH 4.4～4.8 范围内相对稳定，且在pH 4.6 时，ΔI 值最大，故本实验选择pH 4.6 的BR 缓冲溶液35 μL 控制体系的酸度。

2.2.2 AuNPs 用量的影响 实验了AuNPs 用量对体系ΔI 值的影响。结果表明，当AuNPs 用量在25～40 μL 时，体系的ΔI 值逐渐增大;继续增加AuNPs 用量，体系的ΔI 值降低。因此，本实验选择AuNPs 的用量为40 μL。

2.2.3 NaCl 用量的影响 固定已优化的实验条件，探讨了0.5 mol/L NaCl 溶液的用量对反应体系的影响。结果表明，随着NaCl 溶液用量增加，体系ΔI 值不断变大，NaCl 溶液用量为50 μL 时，ΔI 达到最大值。因此，本实验选择适体用量为50 μL。

2.2.4 反应时间的影响 研究了反应时间在5 ～60 min 范围内体系的RLS 强度的变化。实验表明，反应25 min 时，体系的ΔI 达到最大值，随着时间继续增加，体系的ΔI 值恒定不变，体系的稳定性良好。故本实验选择反应时间为25 min。

2.3 干扰实验

在最佳实验条件下，腺苷浓度为1.5×10－11mol/L，实验了可能共存的多种离子或物质对体系的影响。结果表明，当相对标准偏差≤5%时，1 000 倍的葡萄糖;260 倍的尿素;223 倍的;200 倍的Na+、K+、Ag+、Cl－、NO3－;100 倍的Pb2+、Hg2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、、F－、Br－、;82 倍的草酸;67 倍的EDTA 二钠、Zn2+、Fe3+、Ba2+、尿苷、胸苷;47 倍的鸟苷;45 倍的I－、Cu2+;9 倍的胞苷等对测定没有影响，可见该法有较好的选择性。

2.4 标准曲线、检出限及精密度

按照实验方法，加入不同体积腺苷标准溶液，绘制标准曲线。结果表明，腺苷的浓度在1.9 ×10－12～2.0×10－11mol/L 范围内，与体系ΔI 有良好的线性关系，其回归方程为ΔI =71.3 +17.0c(×10－12mol/L)，相关系数r=0.994 8。根据11 次空白样品的平行测定，按公式LOD=3Sb/k(Sb和k 分别为空白管的标准差和直线回归方程的斜率)计算，可得本方法的检出限为5.7 ×10－13mol/L。平行配制11 管浓度分别为1.0 ×10－12，1.5 ×10－11，2.0 ×10－11mol/L的腺苷标准溶液进行精密度实验。结果相对标准偏差(RSD)分别为1.48%，3.70%和2.52%。

2.5 样品分析

采集南华大学学生尿样1 和南华大学附属第一医院糖尿病病人尿样2 和脑梗阻病人尿样3 各1 mL，以3 500 r/min 的 速 度 离 心10 min，用0.22 μm 针头式过滤器过滤，取上清液，按实验方法进行操作，测定样品中的腺苷含量和加标回收率，结果见表1。

表1 样品中腺苷检测结果(n=6)Table 1 Determination results of adenosine in the samples(n=6)

3 结论

在优化的实验条件下，腺苷与腺苷适体特异性结合，AuNPs 失去适体的保护而聚集，导致体系的RLS 强度显著增强，且在一定的浓度范围内，体系的ΔI 与腺苷的浓度有良好的线性关系，据此建立了尿样中痕量腺苷的检测新方法。本方法应用于实际尿样中腺苷的检测，简单、快速、选择性好、检出限低。

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