五色梅总黄酮含量测定与自由基清除活性分析

张伟+吴静姝+宋照风+李艺英+潘嘉慧+朱峰

摘要：以70%乙醇为溶剂，运用超声辅助和加热回流法提取了五色梅（Lantana camara L.）根、茎、叶、果和花中的总黄酮。采用分光光度法测定了五色梅根、茎、叶、果和花中总黄酮含量。结果表明，五色梅花的总黄酮含量最高，为6.16%，其次是叶，含量为3.54%，根、茎和果的总黄酮含量依次为0.18%、1.76%和1.17%。五色梅叶的乙醇粗提物具有有效的羟基自由基清除活性。

关键词：五色梅（Lantana camara L.）;黄酮;含量测定;分光光度法;自由基清除活性

中图分类号：Q949.95;S58        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）21-5227-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.046

Determining the Content of Total Flavonoids in the Lantana camara L.

and Scavenging Activity of Free Radical

ZHANG Wei1，WU Jing-shu2，SONG Zhao-feng2，LI Yi-ying3，PAN Jia-hui4， ZHU Feng2

（1. Conghua College of Guangzhou Medical University， Conghua 510925， Guangdong， China; 2. Department of Chemistry and Chemical Engineering， Foshan University， Foshan 528231， Guangdong， China; 3. CAS-FS Biotech and Pharmaceutical Center， Foshan 528231， Guangdong， China; 4. Foshan Supervision Testing Center of Quality and Metrology， Foshan 528200， Guangdong， China）

Abstract： Using 70% ethanol as extraction solvent， the total flavonoids in the root， stem， leaf， fruit and flower of the plant Lantana camara L. were extracted by ultrasonic heating reflux， and determined by spectrophotometry. The results showed that the highest content of the total flavonoids was 6.16% in the flower， followed by 3.54% in the leaves. The content of the total flavonoids in the root， stem， and fruit was 0.18%， 1.76%， and 1.17%. Ethanol extracts from Lantana camara L. leaf had the effective scavenging activity of hydroxyl radical.

Key words： Lantana camara L.;flavonoid;content determination;spectrophotometry;free radical scavenging activity

药用植物中的黄酮类化合物由于具有多种生物活性而备受关注。如槐花米中的芦丁[1]和血橙皮[2]中的橙皮甙具有维生素P样作用，能维持血管正常渗透压，减低血管的脆性。葛根中的葛根黄酮[3]和银杏中的银杏黄酮[4]，具有扩张冠状血管作用。

五色梅（Lantana camara L.）为马鞭草科马缨丹属一年生或多年生半藤本状灌木，具有清热解毒、散解止痛、祛风止痒的功效，能治感冒高热、痢疾、肺结核等病症[5]。茎叶煎汤洗治湿疹、皮炎，捣烂敷患处能治跌打筋伤。有关生物活性研究表明，该植物粗提物表现出驱虫杀虫活性[6，7]、抗菌抗病毒活性[8-11]等。该植物精油[12，13]具有抗菌和细胞毒活性，但其化学组成随着植物样品采集时间和地点不同而不同。另外，国内外研究者还系统研究了该植物的化学成分[14，15]，不仅发现了许多新的萜类和萘醌类等化合物，也发现了新的黄酮类化学成分，比如Camaraside[16]、Linaroside[17]、Lantanoside[17]、Camaroside[18]和3-methyl quercertin[19]。本试验首次通过分光光度法测定了五色梅根、茎、叶、果和花中总黄酮的含量，并评价了其清除羟基自由基的活性。

1  材料与方法

1.1  材料、试剂和仪器

五色梅根、茎、叶、果和花样品于2013年12月采集于佛山科学技术学院北院校区，根据文献[5]鉴定为五色梅。新鲜五色梅根、茎、叶、果和花用去离子水洗净、风干、粉碎，备用。

芦丁标准溶液（精确称取15 mg芦丁标准试剂，用70%乙醇溶解并定容至100 mL）。95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸均为分析纯。

UV-2501PC型紫外-可见吸收光谱仪（日本岛津公司）。

1.2  方法

1.2.1  总黄酮的提取  准确称取5 g五色梅根干燥粉末，加入100 mL 70%乙醇，在温度为50 ℃和功率为90 Hz条件下超声提取3次，每次4 h。70%乙醇提取液过滤合并，滤渣再加100 mL 70%乙醇加热回流提取1次，提取时间2 h。超声提取和加热回流提取的乙醇溶液合并，于50 ℃真空旋转蒸发浓缩至约50 mL。浓缩提取液转移至250 mL容量瓶，用70%乙醇定容，得到五色梅根总黄酮待测液。五色梅茎、叶、果和花的总黄酮提取按同法操作。

1.2.2  总黄酮定性分析

1）荧光试验。分别取1 mL五色梅根、茎、叶、果和花待测液，在沸水浴上蒸干，加入硼酸的饱和丙酮溶液以及10%枸橼酸丙酮溶液各1 mL，继续蒸干。将残渣在紫外灯下照射，观察荧光现象。

2）氨显色反应。将五色梅根、茎、叶、果和花待测液各滴于滤纸上，风干后用氨气熏蒸，观察颜色变化。

1.2.3  总黄酮含量测定  精确吸取芦丁标准溶液2.00 mL置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至10 mL，摇匀，加50 g/L亚硝酸钠溶液0.7 mL，摇匀后放置6 min，再加100 g/L硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀后放置6 min，再加入40 g/L氢氧化钠溶液5 mL，用70%乙醇定容至25 mL，摇匀后放置10 min。以70%乙醇为空白对照，在420～600 nm内进行波长扫描，测定其最大吸收波长。

线性回归方程的建立：分别精确吸取芦丁标准溶液0～10 mL于25 mL容量瓶中，梯度1 mL，加入70%乙醇至10 mL，然后按测定波长的方法操作，在505 nm波长下分别测定其吸光度。

精确移取“1.2.1”五色梅根待测液1.5 mL置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至10 mL，然后按测定波长的方法操作，在505 nm波长下测定其吸光度值，3次平行，取平均值带入线性回归方程，计算总黄酮含量。五色梅茎、叶、果和花待测液总黄酮含量按相同方法测定。

采用加样法进行回收率的测定。分别精确移取“1.2.1”五色梅根、茎、叶、果和花待测液各1、2、3 mL置于25 mL容量瓶中，加入芦丁标准液1 mL，再按样品总黄酮含量测定方法测定其吸光度值，计算回收率。

1.2.4  羟基自由基清除活性  移取2 mmol/L硫酸亚铁1 mL于10 mL刻度试管中，加入6 mmol/L双氧水1 mL，摇匀后加入6 mmol/L水杨酸1 mL，摇匀，置于37 ℃水浴恒温15 min，立即测定其吸光度值，记为A0。然后精确移取“1.2.1”五色梅根待测液1～7 mL加入试管，加水至10 mL，摇匀，静置10 min，立即测其吸光度值，记为Ax。计算羟基自由基清除率。

羟基自由基清除率=[（A0-Ax）÷A0]×100%

五色梅茎、叶、果和花待测液清除羟基自由基的活性按相同的方法操作。

2  结果与分析

2.1  黄酮定性分析

2.1.1  荧光试验  五色梅根、茎、叶、果和花提取液反应残渣在紫外灯下照射均观察到强烈的荧光现象，表明提取液含有黄酮或黄酮甙。这是黄酮类化合物的典型反应。

2.1.2  氨显色反应  五色梅根、茎、叶、果和花提取液滴于滤纸上风干后经氨气熏蒸后，立刻呈现亮黄色，紫外灯下照射观察更为明显。氨气熏蒸后放置一段时间，颜色因氨气挥发而褪色。这是黄酮类化合物的典型特征。荧光试验和氨显色反应结果均表明五色梅根、茎、叶、果和花的提取液中含有黄酮或其甙类。

2.2  总黄酮含量测定

通过波长扫描，获得芦丁标准品的最大吸收波长为505 nm，故确定505 nm为测定波长。以芦丁浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，通过最小二乘法进行线性拟合，得到线性回归方程为A=0.010 54 C+0.024 23，R2=0. 992 21。

将五色梅根、茎、叶、果和花待测液在505 nm波长下测得的吸光度（A）代入线性回归方程，计算待测液中总黄酮含量并换算成每克生药干粉样品中的总黄酮含量，结果见表1。表1结果表明，五色梅花的总黄酮含量最高，达6.16%，其次是叶，含量为3.54%，然后是茎和果，含量分别为1.76%和1.17%，根中的总黄酮含量最少，为0.18%。

2.3  羟基自由基清除活性试验

参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，利用双氧水与二价铁离子混合后产生的羟基自由基，但羟基自由基反应活性强，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕捉羟基自由基并生成有色物质。该物质在波长510 nm处有强吸收，若加入具有清除羟基自由基活性的样品，则会与水杨酸竞争羟基自由基，从而减少有色物质的生成量。采用固定时间法，在波长510 nm处测定样品反应液的吸光度，并与未加入样品的空白液的吸光度比较，根据公式计算出样品对羟基自由基的清除率。试验结果见图1。

从图1可以看出，五色梅根、茎、叶、果和花的乙醇提取液均表现出一定程度的羟基自由基清除活性，而且随着提取液体积的增加，活性也逐渐增强。其中五色梅叶的乙醇提取液活性最强，并且随着提取液体积的增加，其活性更强。

3  小结与讨论

以70%乙醇为溶剂，联合运用超声辅助和加热回流法提取了五色梅根、茎、叶、果和花样品中的总黄酮。采用分光光度法，以芦丁标准品为对照，在505 nm波长下测定了五色梅样品中的总黄酮含量，结果五色梅花的总黄酮含量最高，其次是叶，根的总黄酮含量最少。回收率试验结果表明该方法可靠。

采用分光光度法测定了五色梅70%乙醇提取液样品对羟基自由基的清除活性，结果显示五色梅根、茎、叶、果和花样品乙醇提取液均具有一定程度的羟基自由基清除活性，且其活性均随着提取液加入量的增加而变强，其中叶提取液的清除作用最强，其次是花，然后依次是茎、果和根。

分析样品总黄酮含量和清除自由基活性效果后发现，羟基自由基清除率与样品中总黄酮含量不呈正比关系，原因是提取液样品中除了含有具有羟基自由基清除作用的黄酮类化合物之外，还含有具有同样作用的其他类型化合物，而这些物质在五色梅不同部位中的含量与总黄酮含量不一致。根据研究结果[20]分析，可能是因为五色梅叶中高含量的五环三萜类化合物Lantadenes导致叶提取液具有更强的羟基自由基清除活性。

综上所述，五色梅不同部位均含有一定量的总黄酮，特别是其叶的乙醇提取物表现出较高的羟基自由基清除活性，因而药用植物五色梅值得进一步研究和开发。

参考文献：

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（责任编辑  赵  娟）

采用分光光度法测定了五色梅70%乙醇提取液样品对羟基自由基的清除活性，结果显示五色梅根、茎、叶、果和花样品乙醇提取液均具有一定程度的羟基自由基清除活性，且其活性均随着提取液加入量的增加而变强，其中叶提取液的清除作用最强，其次是花，然后依次是茎、果和根。

分析样品总黄酮含量和清除自由基活性效果后发现，羟基自由基清除率与样品中总黄酮含量不呈正比关系，原因是提取液样品中除了含有具有羟基自由基清除作用的黄酮类化合物之外，还含有具有同样作用的其他类型化合物，而这些物质在五色梅不同部位中的含量与总黄酮含量不一致。根据研究结果[20]分析，可能是因为五色梅叶中高含量的五环三萜类化合物Lantadenes导致叶提取液具有更强的羟基自由基清除活性。

综上所述，五色梅不同部位均含有一定量的总黄酮，特别是其叶的乙醇提取物表现出较高的羟基自由基清除活性，因而药用植物五色梅值得进一步研究和开发。

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（责任编辑  赵  娟）

采用分光光度法测定了五色梅70%乙醇提取液样品对羟基自由基的清除活性，结果显示五色梅根、茎、叶、果和花样品乙醇提取液均具有一定程度的羟基自由基清除活性，且其活性均随着提取液加入量的增加而变强，其中叶提取液的清除作用最强，其次是花，然后依次是茎、果和根。

分析样品总黄酮含量和清除自由基活性效果后发现，羟基自由基清除率与样品中总黄酮含量不呈正比关系，原因是提取液样品中除了含有具有羟基自由基清除作用的黄酮类化合物之外，还含有具有同样作用的其他类型化合物，而这些物质在五色梅不同部位中的含量与总黄酮含量不一致。根据研究结果[20]分析，可能是因为五色梅叶中高含量的五环三萜类化合物Lantadenes导致叶提取液具有更强的羟基自由基清除活性。

综上所述，五色梅不同部位均含有一定量的总黄酮，特别是其叶的乙醇提取物表现出较高的羟基自由基清除活性，因而药用植物五色梅值得进一步研究和开发。

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（责任编辑  赵  娟）