苎麻cpSSR标记筛选及在亲缘关系研究中的应用

陈平+喻春明+王延周+陈继康+卢凌霄+熊和平

摘要：利用cpSSR引物（叶绿体微卫星）分子标记对苎麻[（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.]属植物进行亲缘关系分析。从22对cpSSR引物中，筛选出5对在苎麻中扩增良好、条带清晰、重复性好的引物，多态性比例为22.73%。5对引物在8份供试材料中共扩增出16条多态条带，平均每对引物的多态性条带为3.2条。聚类分析将这些材料分为3类，分类结果与采用叶绿体基因序列分类结果一致。

关键词：苎麻[（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.];亲缘关系;cpSSR

中图分类号：S563.1        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）21-5084-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.008

Screening cpSSR of Boehmeria （L.） Gaudich. and Its Application

in Studying Genetic Relationship

CHEN Ping，YU Chun-ming，WANG Yan-zhou，CHEN Ji-kang，

LU Ling-xiao，XIONG He-ping

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， China）

Abstract： The genetic characteristics of Boehmeria （L.） Gaudich. were analyzed with cpSSR（chloroplast microsatellites） markers. 5 cpSSR primers with excellent amplification result， good repeatability and clear amplification were selected out of 22 pairs（polymorphism rate 22.73%）. 16 polymorphic loci were detected from 8 tested varieties， with an average of 3.2 loci. The tested varieties were classified into 3 groups. The result was consistent with the result of analyzing chloroplast gene sequence.

Key words： [（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.]; genetic relationships; cpSSR

苎麻[（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.]是荨麻科苎麻属的多年生草本作物，是我国特色的纤维作物。苎麻属约有120个种，我国有31个种12个变种[1]，这些资源含有高细度、抗病、抗虫及抗逆等优异基因，是苎麻育种急需的育种材料。正确理解叶绿体的起源、亲缘关系对苎麻新品种选育及品种的整理和研究具有重要意义。已有研究者通过形态学[1]、细胞学[2]及核基因组RAPD等分子标记[3，4]对苎麻属植物进行了亲缘关系研究，不同方法所得结果存在一定差异。

在进化过程中，叶绿体基因组DNA与核基因组相比高度保守，适宜于进行物种的遗传演化研究，广泛应用于植物遗传群体和系统发育分析研究。廖亮等[5]通过ITS、trnL-F序列分析和细胞核型研究苎麻属植物的起源。但序列分析方法需要进行片段测序，对设备要求高，扩增序列要经过连接克隆载体、转化、鉴定等繁琐操作，效率低。叶绿体SSR标记（cpSSR）具有SSR标记的优点，又兼顾叶绿体基因组的特点。研究者已经利用叶绿体分子标记分析了水稻、大豆、柑橘、小麦、烟草、落叶松等[6]植物的亲缘关系。cpSSR在苎麻中的应用尚无研究报道，本研究从多种植物cpSSR引物中筛选适用于苎麻的多态性cpSSR引物，并对荨麻及7个苎麻属植物进行了亲缘关系分析。

1  材料与方法

1.1  试验材料

荨麻及7份苎麻材料见表1，均取自国家种质长沙苎麻圃。

1.2  方法

1.2.1  叶绿体DNA提取  叶绿体的分离采用Percoll密度梯度离心法，参照文献[7]。

1.2.2  cpSSR分析  从相关文献中检索通用性较好的22对cpSSR引物（表2），用于建立苎麻cpSSR分子标记。cpSSR反应体系为（20 μL），包括25 ng/μL模板2 μL、10× Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL、10 μmol/L引物2 μL、2 U/μL Taq酶 0.5 μL，加ddH2O至20 μL反应体系。

PCR热循环程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，引物退火50 s（退火温度视引物Tm值而定），72 ℃延伸50 s，30个循环;72 ℃充分延伸5 min，产物用PAGE胶检测。

1.2.3  数据统计与分析方法  选择清晰且多态性较高的扩增条带进行统计。相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立“0”、“1”组成的原始矩阵。利用NTsys 2.10e软件计的SimQual程序计算相似系数，进而采用UPGMA（非加权平均法）进行聚类分析，获得遗传树状图。

2  结果与分析

2.1  cpSSR引物的多态性分析

合成的22对cpSSR引物中，5对来源于茄科，4对来源于水稻，2对来源于大豆，2对来源于柑橘，9对来源于烟草。用这些引物对8份供试材料DNA进行扩增，仅有来源于茄科的2对cpSSR引物（NTCP9、NTCP40）和3对来源于烟草的cpSSR引物（CCMP2、CCMP3、CCMP10）能检测到多态性条带，多态性比例为22.73%。5对引物对应产生的多态片段分别为2、3、5、2、4个，平均位点数为3.2个。对这些引物进行了重新编号，命名为SPBC1至SPBC5。

2.2  聚类分析

根据各材料间cpSSR标记揭示的遗传相似系数，采用UPGMA方法进行遗传聚类分析，得出聚类分析图如图1所示。由图1可知，各材料间遗传相似系数最小为0.402，最大为0.887。在0.680处，可将供试材料分为3类，荨麻单独为一类;栽培种中苎1号和青叶苎麻为第二类;剩余的为第三类，包括大叶苎麻、悬铃木叶苎麻、序叶苎麻、海岛苎麻和赤麻。第三类在相试系数0.770处分为两支，海岛苎麻、赤麻为一支，大叶苎麻、悬铃木叶苎麻、序叶苎麻为另一支。

3  小结与讨论

本研究参考通用性较好的cpSSR引物，从中筛选出适用于苎麻的引物，建立苎麻cpSSR技术，并在苎麻中应用。22对cpSSR引物中共筛选出5对在苎麻中有多态性并能稳定扩增的引物，多态性比例为22.73%，说明叶绿体SSR具有较好的通用性。从筛选出的多态性cpSSR引物来源分析，2对来源于茄科（SPBC1、SPBC2），3对来源于烟草（SPBC3、SPBC4、SPBC5）。来源于水稻和松树的cpSSR引物未检测到多态性，显示了cpSSR引物具有一定的特异性，与柑橘[12]及落叶松[13]中的研究结果一致。本研究筛选出的引物数量较少，一旦有更多的引物得到开发，cpSSR技术将在苎麻起源与进化等多个研究领域得到广泛应用。

由得到的亲缘关系结果可知，中苎1号和青叶苎麻聚为一类，其形态相似，染色体数都为2n=28条，与形态学、细胞学和分子标记分类结果一致，均划分为苎麻组。与大叶苎麻亲缘关系最近的是悬铃木叶苎麻，属于大叶苎麻组，与邱财生等[4]利用RAPD标记研究结果一致。形态学和核基因组分子标记分类中，赤麻和海岛苎麻也划分在大叶苎麻组，其与大叶苎麻组的亲缘关系较近，但本研究中赤麻、海岛苎麻与大叶苎麻的亲缘关系比序叶苎麻与大叶苎麻亲缘关系远。本试验中，序叶苎麻划入大叶苎麻组。廖亮等[5]通过ITS序列研究苎麻属演化时也发现，序叶苎麻的不同个体聚入序叶苎麻和大叶苎麻等不同的分支，可能是由于组间存在杂交和基因渗透。

参考文献：

[1] 王文采.中国苎麻校订[J].云南植物研究，1981，3（3）：307-328.

[2] 张  波，郑长清，臧巩固.中国苎麻属组群分类及演化研究[J].作物学报，1998，24（6）：775-781.

[3] 郭安平.RAPD分子标记重建我国苎麻属（Boehmeria Jacq）植物亲缘关系的研究[D].长沙：湖南农业大学，1999.

[4] 邱财生，程超华，赵立宁，等.用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系[J].湖北农业科学，2011，50（7）：1499-1501.

[5] 廖  亮，李同建，刘中来，等.基于细胞学和DNA序列的苎麻与其野生近缘类群系统关系研究[J].作物学报，2009，35（10）：1778-1790.

[6] 王化坤，娄晓鸣，章  镇.叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用[J].分子植物育种，2006，4（3）：92-98.

[7] 郑建树，喻春明，陈  平，等.苎麻叶绿体DNA的提取及分析[J].中国麻业科学，2013，35（5）：239-243.

[8] BRYAN G D，MCNICOLL J，RAMSAY G， et al. polymorphic simple repeat markers in chloroplast genomes of Solanaceous plants[J]. Theor Appl Genet， 1999， 99：859-867.

[9] ISHII T，Mccouch S R. Microsatellites and microsynteny in the chloroplast genomes of Oryza and eight other Gramineae species[J]. Theor Appl Genet， 2000， 100：1257-1266.

[10] XU D H，ABE J，GAI J， et al. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans： Evidence for multiple origins of cultivated soybean[J]. Theor Appl Genet， 2002， 105：645-653.

[11] WEISING K，GARDNER R C. A Set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms[J]. Genome， 1999， 42：9-19.

[12] 程运江.柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发[J].华中农业大学学报，2011，30（6）：780-783.

[13] 张新叶，白石进，黄敏仁.日本落叶松群体的叶绿体SSR分析[J].遗传，2004，26（4）：486-490.

（责任编辑  韩  雪）

2  结果与分析

2.1  cpSSR引物的多态性分析

合成的22对cpSSR引物中，5对来源于茄科，4对来源于水稻，2对来源于大豆，2对来源于柑橘，9对来源于烟草。用这些引物对8份供试材料DNA进行扩增，仅有来源于茄科的2对cpSSR引物（NTCP9、NTCP40）和3对来源于烟草的cpSSR引物（CCMP2、CCMP3、CCMP10）能检测到多态性条带，多态性比例为22.73%。5对引物对应产生的多态片段分别为2、3、5、2、4个，平均位点数为3.2个。对这些引物进行了重新编号，命名为SPBC1至SPBC5。

2.2  聚类分析

根据各材料间cpSSR标记揭示的遗传相似系数，采用UPGMA方法进行遗传聚类分析，得出聚类分析图如图1所示。由图1可知，各材料间遗传相似系数最小为0.402，最大为0.887。在0.680处，可将供试材料分为3类，荨麻单独为一类;栽培种中苎1号和青叶苎麻为第二类;剩余的为第三类，包括大叶苎麻、悬铃木叶苎麻、序叶苎麻、海岛苎麻和赤麻。第三类在相试系数0.770处分为两支，海岛苎麻、赤麻为一支，大叶苎麻、悬铃木叶苎麻、序叶苎麻为另一支。

3  小结与讨论

本研究参考通用性较好的cpSSR引物，从中筛选出适用于苎麻的引物，建立苎麻cpSSR技术，并在苎麻中应用。22对cpSSR引物中共筛选出5对在苎麻中有多态性并能稳定扩增的引物，多态性比例为22.73%，说明叶绿体SSR具有较好的通用性。从筛选出的多态性cpSSR引物来源分析，2对来源于茄科（SPBC1、SPBC2），3对来源于烟草（SPBC3、SPBC4、SPBC5）。来源于水稻和松树的cpSSR引物未检测到多态性，显示了cpSSR引物具有一定的特异性，与柑橘[12]及落叶松[13]中的研究结果一致。本研究筛选出的引物数量较少，一旦有更多的引物得到开发，cpSSR技术将在苎麻起源与进化等多个研究领域得到广泛应用。

由得到的亲缘关系结果可知，中苎1号和青叶苎麻聚为一类，其形态相似，染色体数都为2n=28条，与形态学、细胞学和分子标记分类结果一致，均划分为苎麻组。与大叶苎麻亲缘关系最近的是悬铃木叶苎麻，属于大叶苎麻组，与邱财生等[4]利用RAPD标记研究结果一致。形态学和核基因组分子标记分类中，赤麻和海岛苎麻也划分在大叶苎麻组，其与大叶苎麻组的亲缘关系较近，但本研究中赤麻、海岛苎麻与大叶苎麻的亲缘关系比序叶苎麻与大叶苎麻亲缘关系远。本试验中，序叶苎麻划入大叶苎麻组。廖亮等[5]通过ITS序列研究苎麻属演化时也发现，序叶苎麻的不同个体聚入序叶苎麻和大叶苎麻等不同的分支，可能是由于组间存在杂交和基因渗透。

参考文献：

[1] 王文采.中国苎麻校订[J].云南植物研究，1981，3（3）：307-328.

[2] 张  波，郑长清，臧巩固.中国苎麻属组群分类及演化研究[J].作物学报，1998，24（6）：775-781.

[3] 郭安平.RAPD分子标记重建我国苎麻属（Boehmeria Jacq）植物亲缘关系的研究[D].长沙：湖南农业大学，1999.

[4] 邱财生，程超华，赵立宁，等.用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系[J].湖北农业科学，2011，50（7）：1499-1501.

[5] 廖  亮，李同建，刘中来，等.基于细胞学和DNA序列的苎麻与其野生近缘类群系统关系研究[J].作物学报，2009，35（10）：1778-1790.

[6] 王化坤，娄晓鸣，章  镇.叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用[J].分子植物育种，2006，4（3）：92-98.

[7] 郑建树，喻春明，陈  平，等.苎麻叶绿体DNA的提取及分析[J].中国麻业科学，2013，35（5）：239-243.

[8] BRYAN G D，MCNICOLL J，RAMSAY G， et al. polymorphic simple repeat markers in chloroplast genomes of Solanaceous plants[J]. Theor Appl Genet， 1999， 99：859-867.

[9] ISHII T，Mccouch S R. Microsatellites and microsynteny in the chloroplast genomes of Oryza and eight other Gramineae species[J]. Theor Appl Genet， 2000， 100：1257-1266.

[10] XU D H，ABE J，GAI J， et al. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans： Evidence for multiple origins of cultivated soybean[J]. Theor Appl Genet， 2002， 105：645-653.

[11] WEISING K，GARDNER R C. A Set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms[J]. Genome， 1999， 42：9-19.

[12] 程运江.柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发[J].华中农业大学学报，2011，30（6）：780-783.

[13] 张新叶，白石进，黄敏仁.日本落叶松群体的叶绿体SSR分析[J].遗传，2004，26（4）：486-490.

（责任编辑  韩  雪）

2  结果与分析

2.1  cpSSR引物的多态性分析

合成的22对cpSSR引物中，5对来源于茄科，4对来源于水稻，2对来源于大豆，2对来源于柑橘，9对来源于烟草。用这些引物对8份供试材料DNA进行扩增，仅有来源于茄科的2对cpSSR引物（NTCP9、NTCP40）和3对来源于烟草的cpSSR引物（CCMP2、CCMP3、CCMP10）能检测到多态性条带，多态性比例为22.73%。5对引物对应产生的多态片段分别为2、3、5、2、4个，平均位点数为3.2个。对这些引物进行了重新编号，命名为SPBC1至SPBC5。

2.2  聚类分析

根据各材料间cpSSR标记揭示的遗传相似系数，采用UPGMA方法进行遗传聚类分析，得出聚类分析图如图1所示。由图1可知，各材料间遗传相似系数最小为0.402，最大为0.887。在0.680处，可将供试材料分为3类，荨麻单独为一类;栽培种中苎1号和青叶苎麻为第二类;剩余的为第三类，包括大叶苎麻、悬铃木叶苎麻、序叶苎麻、海岛苎麻和赤麻。第三类在相试系数0.770处分为两支，海岛苎麻、赤麻为一支，大叶苎麻、悬铃木叶苎麻、序叶苎麻为另一支。

3  小结与讨论

本研究参考通用性较好的cpSSR引物，从中筛选出适用于苎麻的引物，建立苎麻cpSSR技术，并在苎麻中应用。22对cpSSR引物中共筛选出5对在苎麻中有多态性并能稳定扩增的引物，多态性比例为22.73%，说明叶绿体SSR具有较好的通用性。从筛选出的多态性cpSSR引物来源分析，2对来源于茄科（SPBC1、SPBC2），3对来源于烟草（SPBC3、SPBC4、SPBC5）。来源于水稻和松树的cpSSR引物未检测到多态性，显示了cpSSR引物具有一定的特异性，与柑橘[12]及落叶松[13]中的研究结果一致。本研究筛选出的引物数量较少，一旦有更多的引物得到开发，cpSSR技术将在苎麻起源与进化等多个研究领域得到广泛应用。

由得到的亲缘关系结果可知，中苎1号和青叶苎麻聚为一类，其形态相似，染色体数都为2n=28条，与形态学、细胞学和分子标记分类结果一致，均划分为苎麻组。与大叶苎麻亲缘关系最近的是悬铃木叶苎麻，属于大叶苎麻组，与邱财生等[4]利用RAPD标记研究结果一致。形态学和核基因组分子标记分类中，赤麻和海岛苎麻也划分在大叶苎麻组，其与大叶苎麻组的亲缘关系较近，但本研究中赤麻、海岛苎麻与大叶苎麻的亲缘关系比序叶苎麻与大叶苎麻亲缘关系远。本试验中，序叶苎麻划入大叶苎麻组。廖亮等[5]通过ITS序列研究苎麻属演化时也发现，序叶苎麻的不同个体聚入序叶苎麻和大叶苎麻等不同的分支，可能是由于组间存在杂交和基因渗透。

参考文献：

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[3] 郭安平.RAPD分子标记重建我国苎麻属（Boehmeria Jacq）植物亲缘关系的研究[D].长沙：湖南农业大学，1999.

[4] 邱财生，程超华，赵立宁，等.用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系[J].湖北农业科学，2011，50（7）：1499-1501.

[5] 廖  亮，李同建，刘中来，等.基于细胞学和DNA序列的苎麻与其野生近缘类群系统关系研究[J].作物学报，2009，35（10）：1778-1790.

[6] 王化坤，娄晓鸣，章  镇.叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用[J].分子植物育种，2006，4（3）：92-98.

[7] 郑建树，喻春明，陈  平，等.苎麻叶绿体DNA的提取及分析[J].中国麻业科学，2013，35（5）：239-243.

[8] BRYAN G D，MCNICOLL J，RAMSAY G， et al. polymorphic simple repeat markers in chloroplast genomes of Solanaceous plants[J]. Theor Appl Genet， 1999， 99：859-867.

[9] ISHII T，Mccouch S R. Microsatellites and microsynteny in the chloroplast genomes of Oryza and eight other Gramineae species[J]. Theor Appl Genet， 2000， 100：1257-1266.

[10] XU D H，ABE J，GAI J， et al. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans： Evidence for multiple origins of cultivated soybean[J]. Theor Appl Genet， 2002， 105：645-653.

[11] WEISING K，GARDNER R C. A Set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms[J]. Genome， 1999， 42：9-19.

[12] 程运江.柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发[J].华中农业大学学报，2011，30（6）：780-783.

[13] 张新叶，白石进，黄敏仁.日本落叶松群体的叶绿体SSR分析[J].遗传，2004，26（4）：486-490.

（责任编辑  韩  雪）