原料乳中β-内酰胺酶的检测

文│李瑞娜（河南省濮阳市畜产品质量安全监测检验中心）

牛奶因含有丰富的蛋白质、氨基酸、矿物质等营养成分，已成为人们生活中不可或缺的天然食品。高品质、无污染的牛奶在增强国民身体素质中起着重要作用。当前乳及乳制品质量安全仍存在一定问题，其中最突出的是抗生素的残留。为了掩蔽抗生素的使用，一些不法分子在原料乳中添加β-内酰胺酶这一物质，以降解已使用的抗生素，使之无法检出。2009年全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项小组明确指出β-内酰胺酶为乳与乳制品掩蔽抗生素的违法添加非食用物质之一。新国标《生鲜牛乳收购标准》中，把“抗生素残留”作为了必检项目，并明确规定限量。本文综述了乳制品中β-内酰胺酶的常规检测方法，并介绍了几种新型检测方法。

一、微生物法

微生物法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。崔生辉等运用此原理建立了该酶的检测方法，该方法在牛奶中的检出限为4U/毫升（U为酶的活力单位）。

该方法准确灵敏、应用广泛，但检测时间长、操作复杂、检出限低，仅适用于对舒巴坦敏感的活性β-内酰胺酶的定性检测，不适用于快速检测。侯东军等通过研究影响检测方法的多种因素如原料乳的保藏温度、保藏时间等对试验进行了优化，提高了该检测方法的准确性和可靠性。

二、碘量法

碘量法是根据青霉素或头孢菌素经β-内酰胺酶作用而产生的裂解酸与碘结合，与淀粉竞争游离碘，从而使蓝色的碘淀粉复合物褪色的原理而进行检测的。此法为《中国药典》中规定的检测β-内酰胺酶活性的方法。谢岩黎等采用碘量法对牛奶中的β-内酰胺酶定性、定量分析，间接判断牛奶中是否有β-内酰胺酶残留。结果表明，当酶浓度大于30U/毫升时，可以用直接碘量法对其进行定性分析，用间接滴定法对其进行定量分析。

该法方便快捷、试剂易得、容易操作、再现性好，适于基层检测单位和现场初筛，但该方法对反应时间等条件要求较严格，影响因素多，每次试验均需要设置阳性和阴性对照，存在灵敏度差，检出限高等缺点。

三、酸度法

酸度法是根据青霉素经β-内酰胺酶作用产生裂解酸引起pH变化，使指示剂变色或碳酸钠溶液释放出二氧化碳的压力变化及以碱滴定来设计的。马洁等利用双酸度计法检测了牛奶中β-内酰胺酶的残留量。该方法在磷酸缓冲溶液（PBS）和牛奶中，对β-内酰胺酶的检出限分别为10U/毫升和15U/毫升。

该法具有设备简单、操作方便、检测时间短等优点，适用于大多数实验室，但不能用于酶动力学分析，且无法区分内源性与外源性β-内酰胺酶。

四、色谱法

高效液相色谱法是目前被广泛应用的一种理化检测方法，分直接法和间接法。

1.直接法。直接法是利用牛乳中的青霉素钾或钠在β-内酰胺酶的作用下或碱性条件下，分解成青霉噻唑酸钾或毒霉噻唑酸钠，经高效液相色谱仪检测青霉噻唑酸钾或毒霉噻唑酸钠是否存在，从而判定牛奶中是否存在β-内酰胺酶。赵静枚等利用高效液相直接法对青霉噻唑酸进行了定性检测，结果表明实验方法简便快速，结果准确。

2.间接法。间接法是利用β-内酰胺酶能酶解青霉素的原理，在牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会下降，通过测定青霉素的浓度从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。孙汉文等利用高效液相间接法建立了原乳中活性β-内酰胺酶的液相色谱-串联质谱检测方法，检出限4U/毫升，加标回收率92.3%～95.5%。

该法灵敏度高、结果准确、操作时间短，但检测成本较高，样品前处理较烦琐，检测程序复杂，费用较高，适用于精确测定，可以作为开展仲裁检验的依据。

五、其他检测方法

随着生物化学技术的不断进步，β-内酰胺酶的检测技术不断发展，近年来出现了几种新型的检测方法，相较于以往的检测方法，操作更加简便、结果更准确、灵敏度更高。

1.免疫法。免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原－抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术。免疫分析法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析和酶联免疫吸附法。

姜侃等应用氨苄青霉素抗体，人工制备氨苄青霉素和辣根过氧化物酶的结合物Amp-HRP，建立氨苄青霉素酶联免疫检测方法。应用该方法分别检测样品反应管和阴性对照管中氨苄青霉素，通过比较两者OD450值，间接判断样品中是否含有β-内酰胺酶。结果成功建立了酶联免疫间接快速测定鲜乳中β-内酰胺酶的方法，检测灵敏度可达0.0005U/毫升。结论该方法检测结果准确可靠，可广泛应用于鲜乳中β-内酰胺酶的检测。

张立静等研制出快速、简便、灵敏的免疫胶体金试纸条对牛奶中的β-内酰胺酶进行检测，制备该酶的单克隆和多克隆抗体，并研制出胶体金标记的抗体，组装并优化免疫胶体金试纸条，结果表明确定试纸条对牛奶中TEM1的检测限8U/毫升，虽然该试纸条的最低检测限比文献报道的微生物法的检测限偏高，但试纸条简单、快速。

2.生物传感器法。生物传感器技术是利用生物化学和电化学原理，将生化反应信号转换为电信号，放大和模数转换，测量出被测物质及其浓度。生物传感器按照所基于的特异性生物化学反应的不同，分为酶传感器和免疫生物传感器。酶传感器依赖于酶催化反应的专一性，通过检测反应的产物或/和底物，得到抗生素的含量。

周爽等建立了酶热生物传感器法，用于快速检测酸奶中β-内酰胺酶。在酸奶中添加一定量青霉素G，使样品中β-内酰胺酶充分酶解加入的青霉素G底物，然后直接通过酶热生物传感器进行分析。酶热生物传感器中装备有专一性酶柱，能够特异性地与青霉素G进行反应，并对其含量进行测定。根据震荡反应前后酸奶样品中青霉素G含量的变化，可以推算出酸奶样品中β-内酰胺酶的活性。结果表明该方法样品检出限为2U/毫升，定量限为4U/毫升。与传统微生物法相比，该方法操作简单、仪器可便携，显著节约了检测时间和成本，是传统方法的有力补充，更适合于大规模样品筛查和现场检测。

六、小结

抗生素分解酶的出现及其在乳品中的非法添加而出现的假冒“无抗奶”是新出现的情况，而中国抗生素残留检测中尚无针对该情况的检测标准方法。因此，进一步改进牛奶中抗生素残留的检测方法，增加抗生素分解酶的检测，逐步完善中国标准检测方法，对食品安全和奶牛疾病防控等均具有重要意义。