乳铁蛋白对大肠杆菌生长的抑制与促进研究

孙玥，李畅，冯一兵，李铁晶

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）作为典型的食源性抗菌蛋白，是一种铁结合糖蛋白，主要来源于牛、人、猪等哺乳动物的乳汁中[1]。它不仅参与生物体内铁的转运，促骨细胞生长、分化，而且具有抗微生物、抗病毒、抗氧化、抗癌等功能[2-3]。其中，最突出的功能是其广谱的抗菌活性。尤其是乳铁蛋白在胃蛋白酶水解作用下，释放乳铁蛋白肽（Lfcin）具有更出色的生物活性[4]。大量研究表明[5-7]，乳铁蛋白对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性细菌以及一些真菌表现出良好的抑制能力。人体服用很多抗菌蛋白无毒副作用[8-9]，并且其在体内还可以被蛋白酶降解，双重安全的保证使得抗菌蛋白在食品工业中将有着广阔的应用前景。

大量研究报道[10-12]均重点强调乳铁蛋白作为天然食品防腐剂“低毒高效”的优势，而对乳铁蛋白是否能够促进微生物生长繁殖的问题，鲜有报道。食源性抗菌蛋白的分子本质是蛋白质，可为微生物生长N源和C源两大营养要素[13]。在微生物的生长繁殖过程中，可能促进微生物的生长。因此，本实验以乳铁蛋白为对象，研究其在抑菌试验中，不同浓度作用下，对大肠杆菌生长抑制或促进的情况。通过改变大肠杆菌的初始密度，观察乳铁蛋白抑菌效果的变化，并对比不同来源乳铁蛋白的作用效果，增加实验的可信度。

1 材料与方法

1.1 材料

乳铁蛋白（分别选用以下三个公司的样品：荷兰的DMV、澳大利亚的Tatua Corporate Profile、新西兰的Westland Milk Products）；大肠杆菌：由东北农业大学食品学院微生物实验室提供；UV-2401PC紫外可见分光光度计：日本岛津公司；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；DELTA 320型pH计、电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；试剂配制与培养基配制使用双蒸水。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质含量的测定

总蛋白质的测定采用凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003），配制盐酸标准滴定溶液参考GB/T 5009-1-2003，配制溴甲酚绿-甲基红混合指示剂参考GB/T 5009-1-2003。计算方法如下：

实验中所用的乳铁蛋白样品，均换算为纯蛋白质后配制溶液。

1.2.2 大肠杆菌浊度标准曲线的制作

将对数期的大肠杆菌接种于葡萄糖蛋白胨（PYG）培养基中，接种量为2%，37℃摇床培养，摇床转速120 r/min，选择不同培养时间，用分光光度计（OD625）分别测定培养物的浊度，同时取该浊度的菌液，进行平板菌落计数（GB4789.2-94），得到吸光值-菌密度的标准曲线。

1.2.3 不同浓度的乳铁蛋白对大肠杆菌的抑制作用测定

抑菌性的测定采用微量稀释法，参考美国临床标准委员会推荐的抗菌性的测定方法（NCCLS）[14-15]。选用葡萄糖蛋白胨培养基，接种的大肠杆菌在37℃下培养至对数生长期。具体方法如下，先将乳铁蛋白配置成100 mg/mL的溶液，用孔径为0.22 μm的醋酸纤维膜过滤除菌，再用无菌水将其调整成不同浓度，使得PYG培养基中加入等体积的乳铁蛋白溶液后，得到乳铁蛋白终浓度分别为 0、2、4、6、8、10 mg/mL 的 PYG 培养基。然后将培养17 h的新鲜大肠杆菌接种于培养基中接种比例为2%，混匀，分装于无菌试管中，每支试管3 mL，置于37℃下培养，摇床转速120 r/min，测定625 nm处的OD值。

三组样品均采用上述方法测定抑菌性，每组样品每个浓度设3个平行，重复3次。为保证大肠杆菌菌落总数测定值的稳定和浊度测定的可信度，所有涉及培养基的实验操作均置于冰桶内，单次测定操作时间不超过15 min。

1.2.4 大肠杆菌污染程度对乳铁蛋白抑菌性影响的测定

使用6 mg/mL的样品1的乳铁蛋白添加到PYG培养基中，接种对数期大肠杆菌菌液，接种量分别为2%、3%、4%、5%，使菌密度分别达到 1.01×107、1.51×107、2.01×107、2.52×107cfu/mL，分装于无菌试管中，测定不同时间的浊度，方法同2.3中所述。

1.2.5 数据统计

本研究中所有实验结果的数据均以平均值±标准偏差表示。采用SPSS16.0软件中的单因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan′s多重比较法进行数据统计分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 不同来源乳铁蛋白样品的蛋白质含量

为防止不必问题，各公司样品随机编号为样品1、样品2、样品3，测定各乳铁蛋白样品蛋白质含量的结果，见表1。

表1 不同乳铁蛋白样品的蛋白质含量Table 1 The protein content of different lactoferrin samples

2.2 大肠杆菌菌密度-吸光值的标准曲线

按照1.2.2的方法，以大肠杆菌菌液吸光值（OD625）为横坐标，以菌落总数（cfu/mL）为纵坐标，绘制出吸光值-大肠杆菌菌密度的标准曲线，见图1。

图1 大肠杆菌菌密度-吸光值的标准曲线Fig.1 The standard curve of bacterial density-optical density of Escherichia coli

由图1可得曲线方程式是：y=7.37x+0.2676（R2=0. 9987）。

2.3 不同浓度的乳铁蛋白对大肠杆菌的抑制作用

2.3.1 不同的乳铁蛋白样品对大肠杆菌生长的抑制或促进作用

选择不同浓度的乳铁蛋白分别添加到大肠杆菌的培养基中，考察不同浓度的乳铁蛋白对大肠杆菌生长的抑制或促进作用，结果见图2。

图2 不同的乳铁蛋白样品对大肠杆菌生长的抑制作用Fig.2 Inhibition of different lactoferrin samples on the growth of Escherichia coli

由图2可见，在相同的浓度下，不同乳铁蛋白样品对培养中的大肠杆菌作用略有差异。有人认为Lf的抗菌活性源于乳铁蛋白螯合游离铁离子的特性，使得微生物失去生长所需的铁元素而被抑制[16-17]；还有人指出Lf是通过氨基末端强阳离子结合区域作用于细菌细胞膜，增加其通透性而达到杀菌的作用[18-19]。本实验中不同样品间抑菌活性的差异，可能与各样品的铁饱和程度不同有关。

2.3.2 不同浓度的乳铁蛋白对大肠杆菌生长的抑制作用

不同浓度的乳铁蛋白对大肠杆菌生长抑制作用的结果，见图3。

图3 样品1对大肠杆菌生长的抑制作用Fig.3 Growth inhibition for Escherichia coli in samples 1

培养0～7 h时，在对照组、2 mg/mL组、4 mg/mL组中大肠杆菌的菌密度迅速上升，最先达到稳定期；在浓度为6、8、10 mg/mL的3个组的菌数则无明显变化；在7 h～22 h内，浓度为6、8、10 mg/mL 3个组的菌密度急速上升至稳定期，并且蛋白浓度越大，上升的速率越快。培养结束时，所有实验组的大肠杆菌菌液密度均大于对照组，并且添加的乳铁蛋白浓度越大，最终的菌液浊度增幅度越大，与对照组差异显著，结果见表2。

表2 不同培养时间下样品1对大肠杆菌生长影响的显著性分析Table 2 Significance analysis of Sample 1effect on growth forEscherichia coli in at times

高浓度的Lf在培养初期能显著抑制大肠杆的生长，不论其抑菌机理如何，Lf的抑菌作用存在量效关系[20]，由于E.coli处于对数增长，未被抑制的E.coli最终将呈现自身快速增长的特性。添加Lf的试验组，最终菌数高于空白组，说明Lf提供了促进E.coli生长的营养要素。Lf的本质是蛋白质，可为微生物的生长提供C源和N源，可作为微生物生长的培养基。多数细菌，包括E.coli不能利用大分子蛋白质，说明大分子蛋白质Lf促进E.coli生长的前提是分子的降解。在试验条件下，导致Lf降解的因素很可能是来自菌体裂解后释放的酶类，而这种菌体的裂解是否由于菌体的自溶作用则需要进一步的实验验证。Lf分子被E.coli利用时已经降解，降解的产物和降解的方式的深入研究，将有助于更深刻理解抗菌蛋白的作用。

2.4 大肠杆菌污染程度对乳铁蛋白抑菌性影响

随着初始菌数的增加，乳铁蛋白对大肠杆菌的最长抑菌时间缩短，见图4。

可见，食品原料的初始污染程度显著影响抗菌蛋白的抑菌效果；由于Lf在培养后期能促进细菌生长（见2.3），在食品的保藏中可能导致更严重的食品安全问题。这应是食源性抗菌蛋白类防腐剂开发利用时，需要考虑的问题。如何与其他防腐剂复合处理改善抑菌效果将是很有益的研究。

图4 大肠杆菌污染程度对乳铁蛋白抑菌性影响Fig.4 Effects of pollution degree of Escherichia coli in lactoferrin antibacterial activity

3 结论

Lf在较低浓度（≤4 mg/mL）下，能促进 E.coli生长，在较高浓度（≥6 mg/mL）时能表现出良好的抑菌作用；随着培养时间的延长，不同浓度的Lf最终都能促进E.coli生长，同时，菌数的增幅高于空白组。

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