褶皱假丝酵母产脂肪酶条件及酶学性质研究

张玉芳，单守水

（1.烟台汽车工程职业学院，山东烟台265500；2.烟台大学，山东烟台264005）

脂肪酶能在非水介质中催化如三酰甘油酯等水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类的逆向合成反应，成为一种应用最为广泛的酶类之一[1]。脂肪酶来源广泛，其中利用微生物的生长代谢积累脂肪酶，不仅成本低、易于工业化生产，而且所得到的脂肪酶制剂产品比动植物来源的同类产品具有更好的应用性，比如有着更好的pH、温度适应性，所以成为工业脂肪酶的重要来源[2]。目前研究报道的可以生产脂肪酶微生物大约65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属[3]。随着微生物资源开发的深入以及基因工程技术手段的应用，还会有望不断挖掘和改造出新的、产脂肪酶性能更好的微生物菌种。

海洋中生物多样性温藏着丰富的微生物资源，尤其由于海洋与陆地环境的巨大差异，人们希望从中找到更优秀的产酶微生物并开发利用。本论文以本实验室从海洋中筛选出的一株产脂肪酶的褶皱假丝酵母为菌种，对其产脂肪酶条件及所产酶的酶学性质进行了较系统研究，为进一步开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究菌种

褶皱假丝酵母，本实验室从海洋中筛选并保藏。

1.2 培养基配制

种子斜面培养基（g/L）：无水葡萄糖20，牛肉蛋白胨10，酵母溶解提取物5，琼脂粉20；

种子扩培培养基（g/L）：牛肉蛋白胨10，酵母溶解提取物 5，橄榄油 5，K2HPO42，MgSO40.5；

产酶发酵培养基（g/L）：蔗糖 5，橄榄油 5，K2HPO41，MgSO4·7H2O 1，（NH4）2SO430，pH=7.0；

培养基灭菌：121℃、30 min。

1.3 菌株的活化

将实验室休眠的假丝酵母取出，斜面培养基28℃、72 h活化培养。

1.4 菌种扩培

将活化好的斜面菌种接种到50 mL/250 mL的三角瓶种子培养基中，于30℃，200 r/min振荡培养30 h。检查正常、待用。

1.5 产酶发酵

按10%的接种量接入到100 mL/500 mL三角瓶发酵培养基中，于30℃，200 r/min进行产酶发酵，定时取样，测定菌体生物量，离心取上清液测定脂肪酶的活力。

1.6 粗酶制备

硫酸铵盐析法制得脂肪酶粗品。

1.7 脂肪酶活力测定

采用橄榄油乳化法[4]，40℃，pH7.5条件下每分钟催化产生1 μmol脂肪酸的酶量定义为一个酶活单位。

1.8 菌体生物量测定

发酵液 1500 r/min离心，菌体用10 mL去离子水悬浮，以去离子水为空白对照，用分光光度计在560 nm测定发酵液的吸光度OD560。

2 结果与讨论

2.1 菌体生长与产酶动力学曲线

图1为假丝酵母的细胞生长和产酶动力学曲线。

图1 假丝酵母的生长曲线和产酶曲线Fig.1 Growth and enzyme production curve of Candida rugosa

从图1中看出，细胞从24 h开始进入对数生长期，36 h以后转入生长稳定期。脂肪酶活力随着生物量的增加而增加，细胞进入稳定期后酶活力达到最高，此后随培养时间延长有所下降。

2.2 假丝酵母产酶条件优化

2.2.1 pH对产酶的影响

图2为不同pH对产酶效果的影响。可以看出，当pH为7.0时，发酵液酶活力相对较高，酸性和碱性环境不适合假丝酵母产酶。

图2 pH对产酶的影响Fig.2 Effect of initial pH on enzyme production

2.2.2 发酵温度对产酶量的影响

图3是不同发酵温度对产酶效果的影响。

图3 培养温度对产酶的影响Fig.3 Effect of temperature on lipase production

如图3所示，30℃时假丝酵母产酶量明显高于其他温度条件下的产酶量。说明温度对产酶效果影响显著。

2.2.3 接种比例对产酶的影响

图4是不同接种量对产酶效果的影响。

图4 接种量对产酶的影响Fig.4 Effect of inoculation level on lipase production

从中看出，接种量对产酶量有明显影响。实验结果说明，接种量10%时发酵产酶活力较高。

2.2.4 发酵培养基组成对产酶的影响

针对三种碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖）的影响研究结果见表1所示。

以5 g/L蔗糖为碳源，不同类氮源（牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵）对假丝酵母产酶的影响，结果见表2所示。

表1 不同碳源及用量对产酶的影响Table 1 The effect of different and consumption carbon source on lipase production

表2 不同氮源及用量对脂肪酶产生的影响Table 2 The effect of different and consumption nitrogen source on lipase production

表1实验结果所示，以蔗糖或淀粉为碳源发酵产生的脂肪酶活相比最高，葡萄糖最差。这与有关文献的结果相同[5-6]。表2结果显示，无机氮比有机氮更加显著地有利于假丝酵母产酶，假丝酵母产酶选择硫酸铵为宜。

2.2.5 振荡频率对产酶的影响

以5 g/L蔗糖、10 g/L硫酸铵为碳、氮源，研究不同的震荡频率对不同发酵浓度下产酶量的影响，实验结果见图5所示。提高震荡频率可以提高发酵液中溶氧量，从而提高产酶量。

图5 震荡频率对产酶的影响Fig.5 Effect of shaking frequency on lipase production

根据上述实验结果，确定褶皱假丝酵母发酵产脂肪酶的较优条件为：蔗糖5 g/L，橄榄油5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，（NH4）2SO410 g/L，起始 pH为7.0，接种量10%，在30℃、200 r/min下培养 36 h，产酶能力达到 4351.6 U/mL。

2.3 假丝酵母脂肪酶的酶学性质

2.3.1 酶作用的最适温度

在不同温度下测定褶皱假丝酵母脂肪酶粗品的活力，结果如图6所示。

图6 温度对酶活力的影响Fig.6 Relationship between temperature and enzyme activity

酶作用最适温度为30℃～40℃，超出这一温度范围，酶活力迅速下降。

2.3.2 酶作用的最适pH

按照酶活力测定方法，于37℃测定相同酶液在不同pH条件下的酶活力。结果如图7所示。

图7 pH对酶活力的影响Fig.7 Relationship between pH and enzyme activity

此酶的最适作用pH为7.5，在pH 7.3～7.7范围内比较稳定。

2.3.3 金属离子对酶活的影响

在酶测定体系中加入不同浓度的金属离子，37℃和pH 7.5条件下保持1 h后测定酶的残留活力，以原始酶活为100%，结果如表3所示。

表3 金属离子对酶活的影响Table 3 The effect of metal ion on enzyme activity

几种金属离子中，Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用，随着Ca2+浓度的增大，酶活先升后降；而Na+对酶有一定抑制作用。

3 结论

1）褶皱假丝酵母的最优产酶条件

发酵培养基：浓度45%（蔗糖5 g/L，橄榄油5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，（NH4）2SO410 g/L；

培养条件为：接种量 10%，pH7.0，培养温度为30℃，200 r/min，发酵36 h，脂肪酶活力可达到4351.6g/L。

2）褶皱假丝酵母产脂肪酶的动力学特性

褶皱假丝酵母产脂肪酶在33℃～38℃，pH 7.4～7.6范围内稳定，最佳反应条件为37℃、pH 7.5；Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用，而Na+对酶有一定抑制作用。

3）金属离子对褶皱假丝酵母产脂肪酶活性影响

在几种金属离子中，适量Ca2++对酶活有一定的促进作用，而Na+对酶有一定抑制作用。

[1] 张树政．酶制剂工业(下册)[M].北京：科学出版社,1984：655-670

[2] 杨继国,林炜铁,吴军林.酶法合成生物柴油的研究进展[J].化工环保,2004,24(2)：116-120

[3] 谈重芳,王雁萍,陈林海,等.微生物脂肪酶在工业中的应用及研究进展[J].食品工业科技,2006,27(7)：193-195

[4] 王福荣,郭风茹,田栖静,等.QB/T 1803-1993工业酶制剂通用试验方法[S].天津：轻工业部食品工业学报,1993

[5] Sharma R,Chisti Y,Banerjee UC．Production, purification, characterization and applications of lipases[J]. Biotechnol Adv,2001,19：627-662

[6] 马晓伟,胡坤,王红香,等.脂肪酶固定化工艺研究[J].中国科技信息,2009(21)：42-45