紫球藻胞外多糖抗氧化和保湿性能的研究

刘红辉，李敏，汲红丽，卫东，孙利芹

（烟台大学生命科学学院，山东烟台264005）

多糖是一类具有多种生物活性的天然大分子物质，在医药、食品、化妆品等多方面具有良好的应用价值。目前对多糖的功能研究主要集中在植物类、真菌和大型海藻、甲壳类等，例如透明质酸、芦荟凝胶、甲壳素及其衍生物、肝素等已经作为天然活性原料用于化妆品行业[1-4]。随着海洋微藻生物技术的发展，尤其是考虑到海洋微藻的生长特性，人们将研究的重点转向海洋微藻多糖的研究。微藻多糖是一种存在于微藻细胞内或胞外的具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射等独特生物活性的天然大分子物质，目前研究较多的主要有螺旋藻多糖、盐藻多糖等[5-7]。由于多糖具有良好的成膜性能，可以减少水分蒸发，因此将其作为功能性添加剂在食品、化妆品领域中将有广泛应用前景。目前，国内外对微藻多糖的吸湿性及保湿性能均鲜有报道，丁红霞等[6]研究了杜氏盐藻多糖在皮肤护理中的作用；我们研究了一种金藻多糖的吸湿、保湿功能[8]，都显示了良好的效果。

紫球藻多糖是由单细胞红藻紫球藻生长至稳定期后向细胞外分泌的一种水溶性黏多糖，一些学者已经报道了紫球藻多糖的抗病毒、降胆固醇、抗辐射和抗肿瘤作用[9-10]。我们前期已经对紫球藻胞外多糖的理化性质及抗肿瘤、免疫调节及自由基清除能力进行了深入研究[11-12]，但尚未有紫球藻多糖吸湿、保湿性能的研究报道。本研究主要考察紫球藻胞外多糖及其降解产品的总抗氧化能力、吸湿性和保湿活性，以期为海洋微藻多糖作为精细化工原料或功能食品基料应用于化妆品、食品行业提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

紫球藻（Porphyridium cruentum）实验用藻株由烟台大学微藻生物技术实验室纯化并保存，紫球藻胞外多糖（EPS0）由烟台大学微藻生物技术实验室分离并保存。

1.2 方法

1.2.1 紫球藻胞外多糖的降解与纯化

采用超声辅助H2O2-VC体系诱导产生的自由基降解紫球藻胞外多糖，称取100 mg多糖，加入各10 mL的抗坏血酸和30%的双氧水，加蒸馏水使反应体系的终体积为22 mL。抗坏血酸和双氧水所选用的终浓度如表1所示。

表1 降解因素水平表Table 1 List of degradation factors and levels

1.2.2 紫球藻胞外多糖及降解产品理化性质的测定

分别采用苯酚-硫酸法[13]、咔唑-硫酸法[14]测定各组分多糖样品的总糖量、硫酸基和糖醛酸含量。

苯酚－硫酸法测定的多糖含量的标准曲线方程为：y=0. 5639x+0. 0338，R2=0. 9931

咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量标准曲线方程为：y=0. 4848x+0. 0136，R2=0. 9811

1.2.3 高效液相体积色谱排阻法测定分子量[15]

色谱条件：色谱柱：TSKGel-5000Pw和TSKGel-4000Pw 串联（10 μm，7.5 mm×300 mm），示差检测器温度为35℃，进样量20 μL；流动相：双重水，流速为0.8 mL/min，分析时间为30 min。

样品处理：将被测样品配成0.2%的溶液，0.22 μm滤膜过滤后，取20 μL滤液注入液相色谱仪，记录色谱图，根据标准曲线计算样品分子量。

（1）线性关系考察：分别精密吸取木香烃内酯对照品和去氢木香内酯对照品混合溶液2、4、6、8、10、12 μL 进样，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品进样量为横坐标（X）、峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，木香烃内酯回归方程为Y＝2×106 X－33 173，r＝0.999 5；表明木香烃内酯在0.4～2.4 µg内具有良好的线性关系；去氢木香内酯回归方程为Y＝1×106 X－56 577，r＝0.999 7；结果表明去氢木香内酯在0.4～2.4 μg内具有良好的线性关系。

1.2.4 多糖样品的总抗氧化能力测定[16]

取不同浓度梯度的多糖样品2 mL，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液和3 mL浓度为1%铁氰化钾溶液充分混合，在30℃水浴中保温40 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，摇匀，4000r/min离心20min，移取3mL上清液于试管中，加3 mL蒸馏水及0.5 mL 0.1%FeCl3，室温下避光反应40min，在700nm处测定吸光值。以相同的浓度梯度VC作为对照，按照上述方法检测。

1.2.5 多糖样品的吸湿活性测定[17]

将待测样品、对照品及多个称量瓶置于真空干燥箱内，50℃烘24 h，准确称取干燥后的EPS0、甘油、透明质酸和壳聚糖各1.00 g于称量瓶中，在环境温度为20℃的条件下，将200 mL饱和氯化钠溶液加入干燥器底部，并保持干燥器内的相对湿度为70%。将称取的样品放入湿度及温度相对恒定的干燥器中并密封。每隔8小时称重一次，并计算吸湿率。

式中：m0为放置前样品及称量瓶总质量，g；mn为放置n小时后样品及称量瓶总质量，g；m为所称量样品的质量，g。

1.2.6 多糖样品的保湿活性测定[17]

保持环境温度为20℃，把250 g变色硅胶置干燥器底部。称取干燥后的 EPS0、EPS1、EPS2、EPS3、甘油、透明质酸和壳聚糖各1.00 g于称量瓶，分别向各瓶中加入1.00 mL蒸馏水，充分混匀，置于干燥器。每隔8 h称重一次，并计算保湿率。

式中：m0为放置前样品及称量瓶总质量，g；mn为放置n h后样品及称量瓶总质量，g；m为所称量样品和1 mL水的总质量，g。

2 结果与分析

2.1 紫球藻多糖降解后经Sepharose-6B柱层析纯化

过氧化氢—VC反应体系中产生大量的羟基自由基使糖苷键断裂来降解紫球藻多糖，降解后的糖液经Sepharose-6B琼脂糖凝胶层析柱纯化，所得的洗脱曲线如图1所示，所获得的3个组份分别命名为EPS1、EPS2和 EPS3。

2.2 多糖组份纯度检测及分子量测定

各组分紫球藻多糖经高效液相色谱的示差折光检测法分析后，所得到的结果如图2至图5所示。

图1 降解后的紫球藻多糖Sepharose-6B凝胶柱层析洗脱曲线Fig.1 Gel filtration chromatography of degradation of polysaccharides on Sepharose-6B

除EPS2外，其余几种组分均为单一对称峰，表明EPS1、EPS3为均一组分；EPS2出现此种现象的原因可能是由于实验过程中分段收集时不够准确，造成成分在一定程度上的混合。通过液相所得的Ve求得Kav值，代入标准曲线方程，计算得出不同组分的多糖的分子量分别为： 3040.88、 1807.59、374.97 和 33.73 ku。

图2 降解后的紫球藻多糖的高效液相色谱图Fig.2 High-performance liquid chromatography of degradation of polysaccharides

图3 EPS1的高效液相色谱图Fig.3 High-performance liquid chromatography of EPS1

图4 EPS2的高效液相色谱图Fig.4 High-performance liquid chromatography of EPS2

图5 EPS3的高效液相色谱图Fig.5 High-performance liquid chromatography of EPS3

2.3 紫球藻胞外多糖及降解产品的理化分析

测得的紫球藻多糖及其降解产品的总糖含量和糖醛酸含量的结果见表2。

表2 P.cruentum多糖的理化性质Table 2 Physicochemical property analysis of polysaccharide from Porphyridium cruentum

如表2所示，EPS0及其降解产品的总糖含量皆在68%以上。采用这一反应体系降解得到的多糖，EPS2的糖醛酸含量较低为3.05%，EPS1糖醛酸含量最高，达11.72%，但糖醛酸含量随着降解程度的增加出现先增加后减少的趋势，可能的原因是多糖一定程度的降解可以使更多的糖醛酸基团暴露，因此测定的含量增加。但是由于糖醛酸基团容易被氧化，随着降解程度的增加，过氧化氢浓度也增加，从而使糖醛酸氧化，而表现为测定浓度降低。

2.4 紫球藻多糖样品的抗氧化能力测定

紫球藻多糖样品的抗氧化能力测定见图6。

图6 紫球藻多糖及其降解产品的抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant activity of polysaccharide and the degraded products

如图6所示，同一浓度下EPS3与对照组VC的总还原能力接近。不同组分的紫球藻多糖的总还原能力大小为：EPS3＞ EPS2＞EPS1＞ EPS0。紫球藻多糖各组分的总还原能力随多糖分子量增大而不断减小。

2.5 紫球藻多糖样品吸湿活性的测定

本实验以甘油（Gly）、透明质酸（HA，分子量100ku）和壳聚糖（CTS，分子量50 ku）为对照品。在环境温度为20℃，相对湿度为70%的恒温恒湿环境下，考察了紫球藻多糖及对照品的吸湿性能见图7。

图7 EPS0、甘油、透明质酸和壳聚糖的吸湿率Fig.7 Absorption rate of ESPS0，glycerin,hyaluronic acid and chitosan

如图7所示，样品及对照品的吸湿率大小的顺序为：Gly＞ ESPS0＞CTS＞ HA。紫球藻多糖样品及对照品的吸湿能力在30 h内增长迅速，30 h后除EPS0和Gly的吸湿能力继续增强外，其余对照样品的吸湿率基本趋于饱和，且Gly吸湿率的增长幅度大于EPS0。180 h即实验结束后，EPS0、Gly、CTS和 HA的吸湿率分别为29.00%、52.90%、14.26%和10.46%。实验结果表明：EPS0、CTS和HA的吸湿率均明显小于Gly，分别小23.9%、38.64%和42.44%，且EPS0的吸湿率比CTS和HA的大，分别大14.74%和18.54%。因甘油中含3个-OH，亲水性极强故其虽为小分子但依然有很大的吸湿率，此外EPS0也表现出了较好的吸湿性能，吸湿率可达29.00%，在样品和对照品当中仅次于Gly。

2.6 紫球藻多糖样品保湿活性的测定

紫球藻多糖及其降解产品的保湿效果如图8所示。

图8 多糖及其降解产品保湿性能Fig.8 Absorption rate of polysaccharide and the degraded fragments

在环境温度为20℃的恒温条件下，利用干燥器法对样品进行保湿活性的研究，实验结果表明多糖样品及对照品的保湿率大小顺序为：HA＞CTS＞EPS0＞EPS1＞EPS2＞EPS3＞Gly。各样品的保湿率随着时间的减小而减小，其中Gly的保湿性最差，HA的保湿性最强，40 h后保湿率依然高达86.10%，HA的保湿率略高于CTS，ESPS0的保湿效果也比较好，保湿效果略差于CTS，40 h后CTS的保湿率为78.40%，EPS0的保湿率为77.73%。田大听[18]等对几种天然多糖的研究结果也证明甘油的保湿性能极差与本实验结果相似，造成这种结果的原因可能是甘油是小分子，在干燥环境中其小分子结构限制了其与水结合的能力。本研究结果表明，4个不同组分的紫球藻多糖均具有良好的保湿性，三者保湿能力都在40%以上，分别为57.17%、54.85%、45.69%和41.39%。

3 结论

紫球藻多糖的降解产品EPS2的糖醛酸含量较低为3.05%，ESPS1糖醛酸含量最高，达11.72%。而ESPS1的总糖含量最高为71.12%，ESPS2的总糖含量相对较低为68.02%，仅次于ESPS0。总体来说各组分的总糖含量相对较高，均在68%以上。

不同分子量的紫球藻多糖抗氧化能力呈现量效关系，且与其分子量大小呈负相关。同一浓度下，EPS3与对照组VC的抗氧化接近。在吸湿活性测定中，EPS0的吸湿率为29.00%，大于CTS和HA的吸湿率，而小于Gly的吸湿率。紫球藻多糖EPS0及其降解产品ESPS1、ESPS2和 ESPS3保湿率分别为 57.17%、54.85%、45.69%和41.39%，都高于甘油，说明紫球藻多糖及其降解产品均具有良好的吸湿和保湿性能，且与分子量大小成正相关。综上，紫球藻多糖及其降解产品是一种良好的抗氧化及保湿剂，具有广泛的的开发与应用前景。

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