海马胆碱能刺激肽促进神经干细胞向神经元分化

杨伟伟 李浩明 金国华△ 田美玲 秦建兵

1（南京中医药大学，南京210023）

2（南通大学医学院人体解剖学系，江苏省神经再生重点实验室，南通226001）

本课题组在近年来的系列研究中发现，切割穹窿海马伞侧海马提取液更能促进神经干细胞（neural stem cells，NSCs）向神经元或乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）阳性的胆碱能神经元分化［1］；在海马提取液的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，切割组与正常组间有多条差异蛋白条带，其中56kD蛋白的条带具有诱导NSCs迁移和向神经元分化的作用［2，3］；进而对56kD蛋白进行电喷雾质谱（ESI-MS）分析，发现其中含有磷脂酰乙醇胺结合蛋白 （phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）［4］。海马胆碱能刺激肽（hippocampal cholinergic neurostimulating peptide，HCNP）是 PEBP N末端11个氨基酸组成的小分子片段。体外细胞培养研究表明，HCNP能够提高培养神经元中ChAT的活性，使乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）表达量增加，并能与神经生长因子 （nerve growth factor，NGF）一起促进胆碱能神经元的分化［5］。本研究在体外培养海马齿状回NSCs培养的基础上，在培养液中加入HCNP，以便更好地研究HCNP在NSCs向神经元或某些特定神经元分化过程中所起的作用。

1 材料和方法

1．1 切割穹窿海马伞侧海马提取液的制备

220-250gSD大鼠6只，雌雄不拘，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent（0．2ml／100g），待动物麻醉后固定于立体定位仪上，暴露前囟，确定前囟坐标A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴），根据Paxinos和Watson图谱确定右侧海马伞的切割范围。先在颅骨上确定两点：（1）A1＝A-1．4、L1＝L-1和（2）A2＝A-1．4、L2＝L-4，切割深度为 V1，2＝ V＋5．4。在两点间划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度，左右往返切割3次后退出针刀，待无颅内出血后，缝合皮肤，肌注青霉素，按性别分笼饲养至14天后，水合氯醛麻醉后，速剥去头部皮肤，置于4℃无菌生理盐水中去除颅骨，沿大脑纵裂切断胼胝体，证实右侧穹窿海马伞确被切断后，取出切割侧海马，移至无菌玻璃研磨器中，按照1ml／100g加入4℃基础培养液，充分研磨后移至5ml离心管中，于4℃下12 000r／min离心10分钟后，将上清液转移，并冻存于-20℃冰箱中备用。

1．2 神经干细胞的培养

孕17dSD大鼠经腹腔注射复合麻醉剂（0．2 ml／100g），消毒后无菌条件下取出胎鼠，置于无菌血清DMEM／F12培养基中，取出海马组织，剔除脑膜、脉络膜及血管等结缔组织，无菌DMEM／F12培养基清洗数次后，加入accutase于37℃消化20min，加入血清终止消化。去除上清后，加入2ml无血清DMEM／F12培养液，用吸管吹打成单细胞悬液，并经孔径为70μm筛网过滤后，1000r／min离心10 min。弃上清，加入3ml加入由无血清DMEM／F12培养基、2%B27、bFGF及EGF配置的神经干细胞培养液，吹打成单细胞悬液，转移至50ml培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养，并定期观察原代神经干细胞球生长情况。

1．3 HCNP对神经干细胞的体外诱导分化

将培养7d的原代神经干细胞球转吹打成单细胞悬液，转移至5ml离心管中，1000r／min离心5 min。弃上清，加入2ml神经干细胞培养液，吹打均匀，1000r／min离心5min后，弃上清，加入1ml神经元分化培养液（DMEM／F12＋2%B27）。用台盼蓝细胞计数法计数细胞，按2×104个／孔接种于预先放置涂有多聚赖氨酸盖玻片的24孔细胞培养板中，每孔加入1ml神经元分化培养液。每板分成3组，每组8孔，各组分别加入：（1）联合培养组：10μl切割穹窿海马伞侧海马提取液及50μl（1pg／μl）HCNP；（2）HCNP组：10μl切割穹窿海马伞侧海马提取液；（3）空白对照组只加入神经元分化培养液。将培养板放入饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中培养，并定期于倒置显微镜下观察神经干细胞分化情况。

1．4 Tuj-1免疫荧光检测

干细胞分化培养第14d时分别进行Tuj-1和MAP-2免疫荧光检测。去除各孔中的培养液，用0．01mol／L PBS（pH 7．2）缓冲液清洗3遍，每孔加入1ml 100%甲醇，4℃固定10min，去除甲醇后加入4%多聚甲醛4℃固定30min，去除多聚甲醛溶液，0．01mol／L PBS（pH 7．2）缓冲液清洗数遍后，加入含10%山羊血清的0．01mol／L PBS（pH 7．2）配置的封闭液，4℃封闭过夜。第二天去除抗体封闭液，加入1∶100稀释的鼠抗Tuj-1和兔抗MAP-2多克隆抗体（Chemicon公司），室温下轻摇1h后放4℃冰箱中孵育，两天后去除一抗，0．01mol／L PBS（pH 7．2）缓冲液清洗3遍，再加入1∶500 稀释的山羊抗小鼠568或羊抗兔568抗体200μl，避光4℃孵育过夜，次日清晨除去抗体，0．01mol／L PBS（pH7．2）缓冲液清洗3遍，每孔再加入200μl 1∶1000稀释的Hochest，避光4℃孵30min，去除Hochest，0．01mol／L PBS（pH 7．2）缓冲液清洗3遍、20%甘油缓冲液封片，在荧光显微镜下计数Tuj-1阳性神经元数目，并观察胞体和突起的生长情况。

1．5 统计学处理

数据以±s表示，采用SPSS 13．0软件进行正态性及方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2．1 Tuj-1免疫荧光检测及数据分析

Tuj-1检测结果显示，HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组（见图1A，B，C）中Tuj-1阳性细胞的数量明显多于HCNP组（见图1D，E，F）和对照组（见图1G，H，I），并且神经元突起在数量、粗细和长度上明显优于其他两组；HCNP组Tuj-1阳性细胞数量多于对照组，神经元胞体较对照组大，突起较长。统计学分析显示，单因素方差分析中各组之均有显著差异（P＜0．05）；HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组中细胞Tuj-1阳性率为10．641±3．079%（P＜0．05）；HCNP组细胞Tuj-1阳性率为5．634±1．874%（P＜0．05）；空白对照组中细胞Tuj-1阳性率为2．254±0．832%（P＜0．05）。同时，使用捷达801图像处理系统对Tuj-1阳性神经元成熟度（神经元周长）进行统计，其中HCNP＋切割海马伞海马提取液组为（1376．18±388．89）μm，HCNP组为（640．07±137．53）μm，空白对照组为（220．45±79．87）μm。

图1 Tuj-1与Hoechst免疫荧光检测（400×）Fig 1 The neurons differentiated from NSCs in plate were detected by Tuj-1immunofluorescence（400×）

图2 各组间细胞Tuj-1阳性率对照Fig 2 The percentages of Tuj-1neurons in different groups．

2．2 MAP-2免疫荧光检测及数据分析

MAP-2免疫荧光检测结果与Tuj-1免疫荧光检测结果相似（具体见图3和图4）捷达801图像处理系统对MAP-2阳性神经元周长进行统计，HCNP与切割海马伞海马提取液联合培养组为（2050．10±496．38）μm，HCNP组为（1140．55±281．32）μm，空白对照组为（613．73±136．60）μm。

3 讨论

神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）具有分裂、增殖特性和多分化潜能，这就使其成为治疗中枢神经系统损伤和神经退行性病变的理想细胞。但是影响NSCs分化为神经元的因素十分复杂，研究发现大部分的NSCs都分化成为胶质细胞，仅有少数的分化为神经元［6］。NSCs需要在一系列因子连续的协同作用下才能向神经元或特定表型的神经元分化，如BDNF、NGF、PDGF、5-HT等等。

图3 MAP-2与Hoechst免疫荧光检测（200×）Fig 3 The neurons differentiated from NSCs in plate were detected by MAP-2immunofluorescence（200×）

图4 各组间细胞MAP-2阳性率对照Fig 4 The percentages of MAP-2neurons in different groups

HCNP是今年来新发现的一类与神经元向胆碱能神经元定向分化相关的小分子肽片段。它由PEBP N末端的11个氨基酸组成，研究发现人海马HCNP在25～30周胎龄的胎儿中表达迅速升高，在出生前达到最高峰，此后缓慢下降，10岁时达到正常人水平，提示HCNP在海马的发育中发挥重要的作用［7］。HCNP与 Alzheimer＇s病等认知功能障碍的神经退行性疾病有关，体外内侧隔核神经元细胞培养过程中发现，HCNP能够提高乙酰胆碱（Acetycholine，ACh）的合成和胆碱乙酰转移酶（Choline acetyl transferase，ChAT）的活性，并能与NGF一起促进胆碱能神经元的分化［8］。然而HCNP在NSCs向神经元或特定表型神经元分化中起何作用，至今尚未见报道。本课题主要研究海马胆碱能神经再生过程中HCNP对海马齿状回自体NSCs向胆碱能神经元分化的促进作用，为临床应用HCNP治疗AD等认知障碍疾病提供实验依据。

本研究发现，与空白对照组相比，在NSCs培养液中加入HCNP后，NSCs向神经元分化的比例明显增加，且形成的神经元突起也较空白对照组明显丰富，提示HCNP能够在一定程度上促进NSCs向神经元的分化。此外，HCNP与切割穹窿海马伞提取液联合培养组与HCNP组以及空白组相比，神经元胞体及突起数量、长度均优于HCNP组及空白对照组，其神经元成熟度也明显优于其他两组。本课题组以往的实验已经证实，切割穹窿海马伞提取液，能够有效的促进体外培养的NSCs或者放射状胶质细胞向神经元的分化，本实验也发现在HCNP中加入切割穹窿海马伞提取液后，其促进NSCs向神经元分化的效果也较单纯使用HCNP更为显著，以上实验结果均提示切割穹窿海马伞提取液中存在某些能够有效促进NSCs向神经元分化的相关因子，需要进一步深入研究。

通过本实验，我们可知HCNP除能与NGF一起促进神经元向胆碱能表型的神经元分化，还能有效的促进NSCs向神经元分化。HCNP是一种小分子肽片段，且仅由11个氨基酸组成，与其他相关因子相比，体外人工合成较为方便，我们的研究为NSCs向神经元定向分化的研究提供了新的思路，也为HCNP的临床治疗奠定了研究基础。然而，HCNP在NSCs向神经元定向分化中究竟如何发挥作用，以及HCNP是否也参与了源自NSCs的新生的不成熟神经元向某些特定表型的成熟神经元的分化，这些问题仍然值得我们深入的研究。

［1］ Zhang X，Jin G，Tian M，et al．The denervated hippocampus provides proper microenvironment for the survival and differentiation of neural progenitors［J］．Neurosci Lett，2007，414（2）：115-120．

［2］ 陈蓉，金国华，田美玲，等．海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞迁移的作用［J］．神经解剖学杂志，2005，21（4）：372-376．

［3］ 金国华，陈蓉，田美玲，等．海马中56kD诱导人神经干细胞向神经元分化的作用［J］．神经解剖学杂志，2006，22（4）：389-393．

［4］ 朱蕙霞，秦建兵，田美玲，等．切割海马伞海马中56kD差异蛋白的质谱分析［J］．南通大学学报（医学版），2006，26（6）：408-410．

［5］ Ojika K，Mitake S，Tohdoh N，et al．Hippocampal cholinergic neurostimulating peptides（HCNP） ［J］．Prog Neurobiol，2000；60（1）：37-83．

［6］ Nishno H，Hida H，Takei N，et al．Mesencephalic neural stem（progenitor）cells develop to dopaminergic neurons more strongly in dopamine-depleted striatum than in intact stratum［J］．Exp Neurol，2000，164（1）：209-214．

［7］ Pláteník J，Kuramoto N，Yoneda Y．Molecular mechanisms associated with long-term consolidation of the NMDA signals［J］．Life Sci，2000，67（4）：335-364．

［8］ Hironaka N，Tanaka K，Izaki Y，et al．Memory-related acetylcholine efflux from rat prefrontal cortex and hippocampus：a microdialysis study［J］．Brain Res，2001，901 （1-2）：143-150．