见血青的气相色谱-质谱联用分析

胡少南，赵 颖，郑一敏，胥秀英

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

见血青Liparis nervosa(Thunb.)Lindl.［Ophrys nervosa Thunb.］为兰科(Orchidaceae)羊耳蒜属植物脉羊耳兰的全草，在全世界热带与亚热带均有分布。在我国主要分布于西南、江西、湖南、福建、台湾及两广地区，其味苦，性凉，具有止血凉血，清热解毒的功效［1］，为民间常用的止血中草药。现代药理研究表明，见血青多糖和总生物碱具有较好的抗氧化性和抑菌效果［2-3］。本课题组研究人员前期制备了见血青的水提取物和不同有机溶剂的萃取得到的极性部位，研究其对小鼠出血、凝血时间的影响及对大鼠各项血液凝集参数的影响。结果表明:见血青具有较好的止血、促凝血作用，推测其作用机制可能与增加FIB含量、抑制纤溶酶活性以及收缩血管有关［4］。为确保见血青合理有效的应用，同时也为开发新的药用资源提供依据，本实验利用GC-MS技术对见血青的不同极性部位进行分析，以期为进一步全面认识见血青化学成分和阐明其药理作用提供参考依据。

1 实验部分

1.1 实验仪器

Aligent 6890 N型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司);电热鼓风干燥箱(重庆银河试验仪器有限公司);高速粉碎机(广州旭郎);RE-5298旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);H-1650型离心机(湖南湘仪仪器有限公司);METTLER AE200S型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);柱层析硅胶(100～200目，200～300目)(山东烟台江友硅胶开发有限公司)。

1.2 实验材料

见血青于2010年9月购自成都市中药材市场，经重庆市中药研究院王昌华副研究员鉴定为兰科植物脉羊耳兰Liparis nervosa的干燥全草，凭证标本存放于重庆市中药研究院中药标本馆。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇均为分析纯(成都科龙化工试剂厂);丙酮、正己烷为色谱纯(安徽时联特种溶剂股份有限公司);水为蒸馏水。

1.3 GC-MS分析条件

1)气相色谱条件:色谱柱为DB-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm× 0.25 μm)，进样口温度为260℃;程序升温条件:初温60℃，保持2 min，以5℃/min升至终温160℃，保持1 min，继续以10℃/min升至终温240℃，保持2 min;载气:He;流速为1.24 mL/min;进样量为1 μL;分流比为20:1。

2)质谱条件:EI离子源，离子源温度为200℃，电离能为70 eV，接口温度为260℃，扫描范围m/z:50～550，溶剂延迟为3 min。

1.4 样品制备方法

将见血青干燥全草在60℃烘箱烘至恒重后粉碎，过40目筛。称取干燥粉末10 g，置于平底烧瓶，加入70%乙醇100 mL，置80℃水浴回流提取2次，每次2 h，合并2次提取液后提取液以10 000 r/min离心除杂后，精密吸取2 mL至25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度线，备测。其余溶液减压浓缩得到浸膏，取浸膏使用干法上样进行硅胶柱层析，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇洗脱2～3个柱体积，分别得到4个流分(Frs.1～4)。各流分减压浓缩后分别转移至25 mL容量瓶中，Frs.1用正己烷定容至刻度，Frs.2用丙酮-正己烷1∶1(V/V)混合液定容至刻度，Frs.3用丙酮-正己烷3∶1(V/V)混合液定容至刻度，Frs.4用丙酮定容至刻度，备测。

1.5 样品测定

精密吸取供试品溶液5种，分别注入气相色谱仪，对见血青各极性部位进行GC-MS分析，得到见血青的GC-MS总离子流图。启动P6890MS化学工作站，通过NIST05-Wiley275质谱库自动检索上述5个样品的质谱数据，确认5种供试品溶液中的化学成分。各成分的相对百分含量根据总离子流图由计算机采用面积百分比法计算得到。

2 实验结果

供试品溶液经GC-MS联用仪分析，得到见血青的GC-MS总离子流图，见图1～5。在确定各对照组分质谱数据和扫描峰号后，用NIST谱库进行检索，并核对标准质谱图及有关资料，从见血青5种供试品溶液中共检测出70个峰，将无标准谱核对结构、含量较低和置信度低的组分、提取分离过程中混入的杂质、溶剂中混入的杂质组分舍去不用，共鉴定出45个化合物。其中:见血青石油醚部位7个，见表1;乙酸乙酯部位7个，见表2;正丁醇部位12个，见表3;甲醇部位5个，见表4;见血青70%乙醇提取液14个，见表5。

图1 石油醚部位GC-MS总离子流图

图2 乙酸乙酯部位GC-MS总离子流图

图3 正丁醇部位GC-MS总离子流图

图4 甲醇部位GC-MS总离子流图

图5 70%乙醇提取液GC-MS总离子流图

表1 见血青石油醚部位化学成分及相对含量

表2 见血青乙酸乙酯部位化学成分及相对含量

表3 见血青正丁醇部位化学成分及相对含量

表4 见血青甲醇部位化学成分及相对含量

表5 见血青70%乙醇提取液化学成分及相对含量

3 讨论

本文采用GC-MS联用技术对见血青不同极性部位的化学成分进行了全面分析，共分离出70个峰，通过检索鉴定了其中45种化合物。其中大多数为有机酸类、有机醇类、酚类、醛酮类以及酯类化合物，共29个;其余组分中，含量较多的是一些含氮的有机化合物类，共8个;含量较少的是一些萜类化合物，仅有2个。

见血青为濒危兰科羊耳蒜属植物，同属植物还有羊耳蒜、大唇羊耳蒜、香花羊耳蒜［5］等。已有文献对羊耳蒜采用GC-MS进行了化学成分研究，其中与本文检测得到的成分相同的有2，3-二氢苯并呋喃、肉豆蔻酸、棕榈酸［6］等，说明同属植物化学成分具有一定相似性，但在本文中检测出胸腺嘧啶，是本课题前期实验中对见血青化学成分系统研究中分离得到的β-胸苷［7］的部分结构，且其相对含量达到11.36%，由此推测见血青中可能含有较多的此类核苷。本实验为拯救濒危兰科药用植物及做进一步的科学研究起到积极作用，为全面认识见血青化学成分和进一步阐明其药理作用提供参考依据。

［1］国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草(24卷)［M］.上海:上海科学技术出版社，1999.

［2］董艳芳，陈法志，郭彩霞，等.见血青多糖的抑菌活性与抗氧化性［J］.湖北农业科学，2012，51(12):2570-2573.

［3］董艳芳，李伟阳，叶睿超，等.见血青总生物碱的抑菌活性和抗氧化性研究［J］.四川大学学报:自然科学版，2010，47(3):669-673.

［4］赵颖，胡少南，王昌华，等.见血青提取物止血作用的实验研究［J］.中国药房，2013，24(31):2884-2886.

［5］关碌，王春兰，肖培根，等.地生型兰科药用植物化学成分及其药理作用研究［J］.中国中药杂志，2005，30(14):1053-1061.

［6］刘杰书，李泳锋，刘金龙.羊耳蒜中化学成分的气相色谱-质谱联用分析比较［J］.时珍国医国药，2010，21(3):529-530.

［7］赵颖，胡少南，王昌华，等.见血青化学成分研究［J］.中草药，2013，44(21):2955-2959.