城市居家环境空气细菌群落结构特征

方治国 ,欧阳志云 ,刘 芃,孙 力,王小勇 (1.浙江工商大学环境科学与工程学院,浙江 杭州 1001；.中国科学院生态环境研究中心,城市与区域生态国家重点实验室,北京 100085；.北京宝洁技术有限公司舒肤佳家庭卫生研究院,北京 100086)

城市居家环境空气细菌群落结构特征

方治国1*,欧阳志云2,刘 芃3,孙 力3,王小勇3(1.浙江工商大学环境科学与工程学院,浙江 杭州 310012；2.中国科学院生态环境研究中心,城市与区域生态国家重点实验室,北京 100085；3.北京宝洁技术有限公司舒肤佳家庭卫生研究院,北京 100086)

在北京市5个方向(东南西北中)共选取31户有小孩的家庭于2009年11月至2010年10月研究了城市居家环境空气细菌的群落结构特征.结果表明,从分离的632株空气细菌中共鉴定出43属细菌,其中革兰氏阳性菌32属,革兰氏阴性菌11属.优势菌属依次为微球菌属(Micrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和库克氏菌属(Kocuria), 分别占 25%～31%,12%～17%,10%～15%,9%～18%,4属细菌百分比约占 63%～71%.在北京市取样的 31户家庭中,空气细菌浓度范围为 47～12341cfu/m3,平均值为1821cfu/m3.总体上,春季和夏季空气细菌浓度分别为 2967cfu/m3和 1742cfu/m3,明显高于秋季和冬季的 1334cfu/m3和 1242cfu/m3(P<0.05).北京市居家环境空气细菌浓度男孩家庭(2123cfu/m3)明显高于女孩家庭(1511cfu/m3)(P<0.01).

居家环境；空气细菌；生物气溶胶；微球菌属；芽孢杆菌属

室内空气质量能够直接或间接影响到人体健康,其对人体健康的影响主要包括生物性污染和非生物性污染[1].空气环境中生物性污染物主要是由霉菌、细菌、病毒、花粉及副产物如内毒素、毒枝菌素等组成的混合物质,其比非生物性污染物更加难以预防和控制[2].长期暴露在这些微生物及代谢产物中可能对人体产生不利的影响[3-4],空气中细菌浓度的增加与流行性疾病及食品污染的发生频率密切相关,并且能够引起人体毒害、过敏、呼吸道疾病、皮肤感染及相关疾病[5].室内空气细菌主要来源于室外或者是以人类为中心如房屋的拥有者及他们的活动而导致的[6],现代城市人们的生活越来越离不开空调,由于人体、房间和空调机会在室内形成了一个封闭的循环系统,容易使细菌、霉菌和病毒等微生物大量繁衍[7-8].室内环境如居家、学校、医院和日托中心空气细菌浓度的增加是人们面临的一个重要问题.由于暴露在空气细菌的环境中,在工作间和居住区人们潜在的健康危险性随时可能发生[9].研究表明,细菌感染的发生概率与年龄密切相关,儿童比成年人更加容易遭受空气细菌潜在的健康危险性,3岁以下的儿童更加容易发生感染[10].因此,研究家有儿童的居住家庭空气细菌群落组成及浓度分布特征具有重要的实际意义,可为儿童细菌性疾病的预防和控制提供科学依据.本文在北京市不同方向选取31户有1～10岁儿童的家庭进行空气细菌取样,系统研究了室内家庭空气细菌群落结构及浓度变化特征,对儿童成长过程中在细菌气溶胶暴露下的健康风险评估具有重要的意义.

1 材料与方法

1.1 研究样点概况

在北京市5个方向(东南西北中)选取 31户家庭于2009年11月至2010年10月进行取样,系统研究北京市居家环境空气细菌群落特征.取样 31户家庭的选择标准:每户家庭都有年龄在1～10岁之间的儿童;居家室内没有肉眼可见的霉菌;没有明显能够闻到的霉味;以前和现在的房屋建筑都没有受到湿度的破坏;所选取样家庭位于北京市东南西北中的不同区域;房屋的建筑年龄和窗户类型各不相同.在选择的 31户家庭当中,东边 3户,南边 3户,西边 4户,北边 9户,中间 4户,南边学校社区3户,北边学校社区5户.因为北京北边聚集着众多的高校,是经济发展非常活跃的区域,也是人口比较密集和人口流动较多的地方,所以在北京市的北边选取了 9户家庭进行取样.所选家庭最大面积约为 125m2,最小面积约为40m2;16户家庭儿童为男孩,15户家庭为女孩,最大年龄10岁,最小年龄2岁;建筑户型21户为板楼,10户为塔楼.

1.2 空气微生物取样器

采用国产 Andersen生物粒子取样器(FA-1,辽阳应用技术研究所)进行取样测定.它是模拟人呼吸道的解剖结构和空气动力学生理特征,采用惯性撞击原理设计制造的.该取样器分为6级,每级 400个孔,从Ⅰ-Ⅵ级孔的直径逐渐缩小,空气流量为 28.3L/min,每一级的空气流速逐次增大,从而把空气中的带菌粒子按大小不同分别捕获在各级培养皿上.

1.3 取样和培养方法

选择相同的天气条件进行室内家庭环境空气细菌的取样工作,每户家庭每个季节取样1次,每次连续取样3d,每d取样1次,每次3个重复,一年四季中31户家庭空气细菌取样工作都是在3d内完成.空气细菌的取样高度为人呼吸带,距离地面约1.5m处.取样空气流量为28.3L/min,采样器各层的孔眼至采样面的距离(即撞击距离)为 2mm,室内空气细菌的取样时间为 3min.取样采用直径为 90mm的一次性塑料培养皿,预先在无菌条件下加入20～25mL已灭菌的细菌培养基,操作时尽量控制培养皿内培养基厚度的一致性,以减少试验的系统误差.空气细菌取样采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏 3～5g,蛋白胨 10g,氯化钠 5g,琼脂,13～17g,蒸馏水 1000ml),采集的样品在 37℃培养箱内培养 48h,然后分别在各级取样培养皿上对细菌菌落进行记数、分离和纯化.

1.4 空气细菌浓度计算方法

由于通过Andersen采样器各筛孔的微生物粒子,超过一定数量后,会出现微生物粒子通过同一筛孔撞击在同一点上的重叠现象,故各级采集的菌落数需经下式校正:

式中: Pr为校正后的菌落数; N为采样器各级采样孔数; r为实际菌落数.

最后根据校正后各级空气带菌粒子的数量,计算空气细菌的浓度,计算方法如下:

式中: C为空气细菌浓度; T为六级总菌落数; t为采样时间; F为空气流量.

1.5 空气细菌菌落挑取和鉴定

在北京市东南西北中 5个方向每个区域各选取 1户家庭,于春夏秋冬每季所采取的空气细菌样品中,挑选1组 (6级共6个培养皿)挑取细菌单菌落,分离和纯化,每个培养皿分离菌落数不少于6个,也不多于8个,每个区域每个季节共鉴定细菌菌落 36～48个,每个区域春夏秋冬四季共鉴定144～184个,北京的5个区域共鉴定细菌菌落 632个.分离纯化后的室内空气细菌采用分子生物学方法进行鉴定,采用细菌 16S rRNA基因通用引物 PCR扩增,纯化、送公司测序,再与NCBI数据库比对获得细菌相关菌种的信息,引物序列为:

27F: 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,

1492R: 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′.

1.6 统计分析和图表制作方法

数据分析和图表绘制用 SPSS Version 17.0和Microsoft Excel 2007进行.

2 结果分析

2.1 居家环境空气细菌种类组成与群落结构

2.1.1 居家环境空气细菌种类组成 居家环境空气中球菌的数量明显多于杆菌(P<0.01),在分离鉴定的 632株细菌样品中,球菌有 383株,占60.6%,杆菌有249株,占39.4.此外,室内空气环境中革兰氏阳性菌(G+)明显多于革兰氏阴性菌(G－)(P<0.001),在分离鉴定的632株细菌样品中,革兰氏阳性菌有573株,占90.7%,革兰氏阴性菌有59 株,占 9.3%.

2.1.2 居家环境空气细菌群落结构特征 由表1可知,在31户家庭共分离纯化的632株细菌样品中,共鉴定出 43属空气细菌,其中革兰氏阳性菌32属,革兰氏阴性菌11属.从鉴定出现的频率来看,优势细菌属依次为微球菌属(Micrococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和库克氏菌属 (Kocuria),4属细菌百分比约占 63%～71%.在优势菌属中,微球菌属约占总数的 25%～31%,芽孢杆菌属占12%～17%,葡萄球菌属占10%～ 15%,库克氏菌属占9%～18%(表1).

表1 居家环境空气细菌群落结构特征Table 1 Community composition of airborne bacteria in family homes

从一年中不同季节来看,春季共发现27属空气细菌,其中革兰氏阳性菌24属,革兰氏阴性菌3属.优势菌属依次为微球菌属、库克氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、皮生球菌属(Dermacoccus)和短杆菌属(Brevibacterium),分别占26.4%、18.2%、12.6%、10.1%、5.0%、3.8%;夏季共发现 26属空气细菌,其中革兰氏阳性菌18属,革兰氏阴性菌8属.优势菌属依次为微球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、库克氏菌属、短波单胞菌属(Brevundimonas)和大单胞菌属(Macromonas),分别占 25.0%、14.3%、14.3%、9.5%、8.3%和3.0%;秋季共发现24属空气细菌,其中革兰氏阳性菌18属,革兰氏阴性菌6属.优势菌属分别为微球菌属、芽孢杆菌属、库克氏菌属、葡萄球菌属、短波单胞菌属、节杆菌属(Arthrobacter),分别占 25.5%、14.7%、12.1%、10.8%、3.8%和3.8%;冬季共发现24属空气细菌,其中革兰氏阳性菌21属,革兰氏阴性菌3属.优势菌属依次为微球菌属、葡萄球菌属、库克氏菌属、节杆菌属和动性球菌属(Planococcus),分别占30.4%、16.9%、12.8%、10.8%、5.4%和4.7%.

2.1.3 居家环境空气细菌群落物种组成 在31户家庭共分离纯化的 632株细菌样品中,共鉴定出43属136种空气细菌. 从鉴定出现的频率来看,室内空气中优势细菌依次为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、玫瑰色库克菌(Kocuria rosea)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、里拉微球菌(Micrococcus lylae)、黄色微球菌(Micrococcus flavus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),分别占14.56%,8.39%,4.75%,3.64%,3.01%,2.69%,2.53%.

2.2 居家环境空气细菌浓度变化特征

2.2.1 居家环境空气细菌浓度背景值 在北京市不同方向取样的31户家庭中,空气细菌浓度最低值为 47cfu/m3,最高值为 12341cfu/m3,算术平均值为 1821cfu/m3,中值为 877cfu/m3,几何平均值为742cfu/m3.

2.2.2 居家环境空气细菌浓度的季节变化 居家环境春季和夏季空气细菌浓度明显高于秋季和冬季(P<0.05),春季细菌浓度最高,其次为夏季,浓度最低的秋季和冬季没有显著差异(图1).北京市居家环境空气细菌浓度春夏秋冬四季分别约为2967,1742,1334,1242cfu/m3.

图1 居家环境空气细菌浓度季节变化特征Fig.1 Seasonal variation patterns of airborne bacterial concentrations in family homes

2.2.3 居住家庭儿童性别对空气细菌浓度的影响 由图2可见,一年中春夏秋3个季节男孩家庭的空气细菌浓度明显高于女孩家庭(P<0.01),冬季男女孩家庭则没有显著差异(P>0.05).总体上,北京市居家环境空气细菌浓度男孩家庭明显高于女孩家庭(P<0.01),男孩家庭为 2123cfu/m3,女孩家庭为1511cfu/m3.

图2 居住家庭儿童性别对居家环境空气细菌浓度的影响Fig.2 Effects of child’s gender on airborne bacterial concentrations in family homes

2.2.4 居住家庭房屋结构对空气细菌浓度的影响 房屋结构对居家环境空气细菌浓度的影响如图3.春季空气细菌浓度塔楼高于板楼(P<0.05),夏季、秋季和冬季板楼和塔楼内的空气细菌浓度没有显著差异(P>0.05).总体上,房屋结构对室内家庭空气细菌浓度没有显著的影响,板楼室内家庭空气细菌浓度的平均值为 1806cfu/m3,塔楼则为1853cfu/m3,两者没有显著差异(P>0.05).

图3 房屋结构对室内家庭空气细菌浓度的影响Fig.3 Effects of apartment’s structure on airborne bacterial concentrations in indoor environment

3 讨论

在北京市不同方向选取了31户有1～10岁儿童的家庭,于2009年11月至2010年10月进行了空气细菌取样,系统研究了室内家庭空气细菌群落结构及浓度变化特征.结果表明居家环境空气中细菌类型 G+多于 G－(P<0.001),前者占90.7%,后者仅占 9.3%,这与国内外学者在室内外环境中的研究结果基本一致[2,11-12],但是在室内外不同环境条件下,G+和 G－百分比含量明显不同[13-14].Aydogdu等[2]在土耳其 Edirne市儿童日托中心室内外研究空气细菌时发现,室内外G+分别占97.16%和95.04%,G－分别占2.84%和4.96%;Shaffer等[13]用相同的培养基和接种条件在森林、海岸、城市和乡村的研究表明,4个生态系统空气环境中 G+和 G－分别占 70.0%～85.0%和15.0%～30.0%[13].研究表明,G+特别是阳性球菌在自然界中分布广泛,能够从自然环境或者人类和动物皮肤、粘膜和其他部位分离到[15].有儿童的家庭居住者活动较多,从而导致阳性球菌从小孩身体的各个部位传递到空气中,引起室内空气中G+浓度增加.2007年,在研究北京市室外环境空气细菌组成时发现,G+约占 80%～85%,G-约占15%～20%[14],比较结果表明,室内环境 G+数量高于室外,而 G-则低于室外,进一步说明室内外不同环境空气细菌来源不同,其 G+和 G－的百分含量差异较大.

北京市居家环境空气中优势细菌属依次为微球菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属和库克氏菌属,其中微球菌属是最为优势细菌属,占总数的25%～31%.这与国内外不同学者对室内外不同环境中空气细菌组成的研究结果基本相似,但也存在一定的差异性[2,9,16-20].Aydogdu等[2]研究发现,土耳其 Edirne市儿童日托中心室内优势空气细菌属依次为葡萄球菌属(58.67%)、微球菌属(10.88%)、棒杆菌属(Corynebacterium)(6.90%)和芽孢杆菌属(6.61%),室外则依次为芽孢杆菌属(28.18%)、棒杆菌属(23.92%)、葡萄球菌属(17.74%)和微球菌属(4.2%); Seino等[16]在东京拥挤的地下公共场所研究时发现,在11属空气细菌中,优势菌属为葡萄球菌属和微球菌属; 韩国医院优势空气细菌属依次为葡萄球菌属(50%)、微球菌属(15%～20%)、棒杆菌属(5%～25%)和芽孢杆菌属(5%～15%)[17];在其他的室内环境如学校[18]、家庭[19]、大学医务所[20]、办公室[21]、公共建筑[9]、图书馆和档案室[22],葡萄球菌属和微球菌属也是其空气中优势细菌属.这些优势菌属主要来源于自然环境或以人类为中心,微球菌属来源于自然环境,并且能够短暂滞留在人类和其他哺乳动物的皮肤,葡萄球菌属能够在人类和其他哺乳动物的皮肤和粘膜中发现.这样微球菌属和葡萄球菌属的细菌能够从人们及宠物的皮肤、口腔、鼻子和头发传播到周围空气中,从而导致室内环境微球菌属和葡萄球菌属数量的增加[2].与以上研究结果不尽相同的是,本研究中芽孢杆菌属是紧随着微球菌属之后室内家庭的第二大优势细菌属,约占总数的 12%～17%,而在Aydogdu等[2]的研究结果中,土耳其 Edirne市儿童日托中心室内空气中芽孢杆菌属是第四大优势细菌属,约占总数的 6.61%,这种差异的出现可能与室内家庭和儿童日托中心不同的人群组成及环境条件密切相关.北京市室外环境优势细菌属依次为微球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属(Pseudomonas)[14],与室内家庭空气细菌的优势菌属既有相似性又有差异性,相似性主要是因为室内空气微生物有一部分来源于室外环境,而差异性主要归因于室内外的环境特点及人们活动特征的不同.

北京市居家空气中的优势菌种,藤黄微球菌占14.56%,主要分布于空气、土壤、水以及动植物体表,可为条件致病菌,能引起伤口等局部组织感染,也能引起严重感染,如心内膜炎等疾病; 蜡样芽孢杆菌占 2.53%,它会引起食物中毒,中毒者症状为腹痛、呕吐腹泻.分离的菌株中,溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)占 1.90%,其多数为非致病菌,少数可导致疾病;表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)占 1.74%,它是滋生于生物体表皮上的一种细菌,在人体的皮肤等部位寄生,属正常菌群类型.葡萄球菌多数为非致病菌,少数可导致疾病.它是最常见的化脓性球菌,是医院交叉感染的重要来源.

北京市居家环境空气细菌的浓度范围为47～12341cfu/m3,算术平均值为 1821cfu/m3,中值为877cfu/m3,这个研究结果明显高于世界上其他国家和地区室内环境空气细菌的浓度.研究表明,波兰图书馆和档案馆空气细菌浓度分别为628cfu/m3和 444cfu/m3[22];土耳其 Edirne市儿童日托中心教室、卧室、吃饭的房间空气细菌浓度分别为 520cfu/m3、496cfu/m3和 390cfu/m3[2];日本东京拥挤的地下公共场所空气细菌浓度在PCA(营养琼脂)培养基上为 512cfu/m3,在CAN(血平板)培养基上为345cfu/m3[16];韩国医院休息室、重症监护室、手术室和治疗室空气细菌浓度分别为 372,202,293,218cfu/m3[17];在敦煌莫高窟封闭洞穴、开放洞穴、半封闭洞穴和入口空气细菌浓度分别为 1300,1100,440,440cfu/m3[23].研究发现,北京市室外空气细菌的浓度明显高于世界上其他国家和地区[14].虽然取样过程、方法和时间的不同,能够引起空气中细菌浓度的差异,但总体而言,北京市空气微生物污染的情况明显严重于其它国家和地区.此外,北京市室外空气细菌浓度范围为 71～22100cfu/m3,均值为2217cfu/m3,明显高于室内家庭的 1821cfu/m3,这与其他科研人员的研究结果基本相同.Zhu等[12]研究发现,美国亚利桑那州Tempe市办公楼室内外空气细菌分别为1987cfu/m3和2332cfu/m3.

北京市居家环境空气细菌浓度春季最高,夏季次之,秋季和冬季最低,这与国内外其它的研究结果不尽相同.研究表明,土耳其Edirne市儿童日托中心室内空气细菌浓度没有明显的季节变化特征;敦煌莫高窟半封闭洞穴和入口空气细菌浓度夏季高于冬季.

此外,北京市居家环境男孩家庭空气细菌浓度明显高于女孩家庭.据报道,在10岁之前女孩总体的活动量只有男孩的一半[24].在室外,男孩会开展一些对地面扰动较大的活动如快速奔跑和地面打滚等,这样就会有很多的带菌粒子会被传到室内家庭;在室内,男孩对地面的扰动也明显强于女孩.并且相对而言,男孩的卫生状况要差于女孩,这就是男孩家庭空气细菌浓度较高的主要原因.

4 结论

4.1 北京市居家环境空气中细菌种类呈现较高的多样性,从分离的 632株空气细菌中共鉴定出43属细菌,优势均属依次为微球菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属和库克氏菌属,总和约占 63%～71%.

4.2 北京市居家环境空气细菌浓度受到时间和空间的影响变化范围较大,最低值为 47cfu/m3,最高值为cfu/m3,算术平均值为cfu/m3.

4.3 居家环境空气细菌浓度季节变化特征明显,春季和夏季明显高于秋季和冬季,且空气细菌浓度受到儿童性别的显著影响,男孩家庭细菌浓度明显高于女孩家庭.

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Airborne bacterial community composition in family homes in Beijing.

FANG Zhi-guo1*, OUYANG Zhi-yun2, LIU Peng3, SUN Li3, WANG Xiao-yong3(1.School of Environmental Science and Engineering, Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310012, China；2.State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China；3.Safeguard Research Institute, Procter and Gamble (Beijing)Technology, Beijing 100086, China). China Environmental Science, 2014,34(10)：2669～2675

The community composition and concentration variation pattern of airborne bacteria were conducted from Nov.2009 to Oct. 2010 in 31 households with children in Beijing. Results showed that 43 genera (32 genera of Gram-positive and 11genera of Gram-negative bacteria)airborne bacteria was identified from 632 isolates. The most common bacterias were members of genera Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Kocuria, and contributed to 5%～31%, 12%～17%,10%～15%, 9%～18% of the total bacterias, respectively. In the selected 31 households, the bacterial concentration in the air ranged from 47～12341cfu/m3, and the mean concentration was 1821cfu/m3. As for the seasonal variation pattern of airborne bacteria, higher bacterial concentration was observed in spring (2967cfu/m3), followed by summer (1742cfu/m3)and autumn (1334cfu/m3), and the lowest in winter (1242cfu/m3). Finally, we also discovered bacterial concentration in households with boys (2123cfu/m3)was higher than households with girls (1511cfu/m3).

family homes；airborne bacteria；bioaerosols；Micrococcus；Bacillus

X513;X712

A

1000-6923 (2014)10-2669-07

2013-12-09

国家自然科学青年基金资助项目(41005085);北京宝洁技术有限公司舒肤佳家庭卫生研究院科技资助项目;中国科学院知识创新工程方向性项目(KZCX2-YW-422);教育部留学回国人员科研启动基金

* 责任作者, 副教授, zhgfang77@zjgsu.edu.cn

方治国(1977-),男,安徽黄山人,副教授,博士,主要从事空气环境微生物学特征研究.发表论文40余篇.