草坪草高羊茅高温诱导抑制差减杂交文库的构建及其表达

王海宏等

摘 要：为了深入研究草坪草对抗高温逆境的分子遗传机制，构建高羊茅在高温胁迫下相关的基因文库。研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象，在长期生理试验的基础上，通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库，挑选部分阳性克隆进行测序，并对所获得的差异基因序列进行分析，研究了在38 ℃/30 ℃（昼/夜）培养箱中进行高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明：试验得到的差减文库中大量组成型表达的基因已经被有效去除，使某些特有的差异基因得到了富集；两个文库的基因片段的长度分布在200～900 bp，平均片段长度约500 bp左右；在构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST测序，共得到100个有效序列，其中38个是未知序列，其余62个为已报道序列，但是序列功能全部未知，这些EST 中有25个与叶绿体染色体有关，其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。本试验最终得到了合格的差减文库并对部分基因进行了测序，可为高羊茅耐热基因的研究提供依据，同时也为提高草坪草水肥调控措施提供了理论基础。

关键词：冷季型草坪草；高羊茅；抗热性鉴定；表达序列标签；抑制差减杂交；生物信息学

中图分类号：S543+.9 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.001

Abstract： In order to study the molecular genetical mechanisms about how turfgrass against heat stress， suppression subtractive hybridization was used to construct cDNA library of tall fescue stress-related genes at a high temperature. Experimental material was cool-season turfgrass tall fescue. On the basis of long-term physiological experiments， by building SSH library of tall fescue under high temperature stress， some positive clones to be sequenced were selected， and the differences in gene sequences were analyzed. Thus， the differences between the control group and treatment group of tall fescue leaf RNA were studied， the treatment group was the plant on the temperature stress of 38 ℃/30 ℃（day / night） incubator for 6 h. The results showed that a large constitutively expressed genes of the subtractive library had been effectively removed， so that some of the specific enrichment of differentially expressed genes obtained； Length of the two gene libraries distributed in 200～900 bp， the average fragment length about 500 bp； in the library， 123 of about 500 bp in size EST to be sequenced were selected randomly， and a total of 100 valid sequences had been got， of which 38 were unknown sequence， and the remaining 62 had been reported， but the entire sequence function were unknown. There were 25 of these EST were related about chloroplast genome， of which 9 were homologous with a submitted fescue plant chloroplast gene. The trial finally got qualified subtracted library， and some genes were sequenced， it may provide the basis for the study of tall fescue resistant genes， as well as provide a theoretical basis of the measures to improve the regulation of turfgrass fertilizer.

Key words： cool-season turfgrasses；tall fescue；heat resistance identification；expressed sequence tags；suppression subtractive hybridization；bioinfomatics

凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas）作为耐热性较好的冷季型草坪草，近年来在亚热带地区得到广泛应用。但是，高温胁迫仍然是影响其夏季成坪效果的首要限制因素，因此，冷季型草坪草的耐热机理、如何提高其耐热性以及培育耐热新品种一直是草业科学的研究热点。传统研究主要从生理生态学角度对比热敏感和耐热植株在热胁迫下的形态和生理特征，以及植株在热胁迫前后的生理生态变化，通过一些物理手段，或者外施一些化学物质来改善草坪草的耐热性。现有研究已经知道植物对环境产生的大多数响应都得通过改变基因表达来实现，因此，与草坪草耐热性相关的基因必然成为深入研究草坪草耐热性的重点和关键问题。

随着现代生物技术的发展和计算机科学与生物学的结合，研究者已经可以系统地了解热胁迫状态下的差异基因表达。基因差异表达的方法有很多种，如差异杂交（Differential Hybridization）、cDNA微点阵杂交（cDNA Microarray Hybridization）、寡核苷酸微点阵杂交（Oigonucleotide Microarray Hybridization）、RNA任意引物PCR指纹（RNA Fingerprinting by Arbitrarily Primed PCR，RNA AP-PCR ）、差异显示反转录PCR （Differential Display RT-PCR， DDRT-PCR ）、基因表达系列分析（Serial A nalysis of Gene Exp ression， SAGE），等等。尽管这些方法均不完善，但是已经有大量的重要基因通过这些方法得到了分离和鉴定[1-2]。

目前分离并克隆草坪草抗逆基因的研究已有部分报道。2005年谢永丽[3]对草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB进行了克隆及功能鉴定；2006年又分离了狗牙根中周期素cyclinD基因片段[4]；Jiang等[5]利用抑制差减杂交的方法研究了耐高温剪股颖的高温胁迫响应基因；Xu等[6-7]在热胁迫下对比了剪股颖耐热与不耐热品种根、茎中的基因差异表达，鉴定和描述了苹果菌素基因AsEXP1与剪股颖耐热性的关系。本研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象，首先构建SSH差减文库，对克隆斑点进行杂交，通过信号扫描获得阳性克隆，然后对上调基因和部分显著下调基因进行测序，获得差异基因序列。然后利用生物信息学方法，以试验所获得的序列为基础，利用提供的软件和数据库，采用网上提交的方法对EST进行序列特征及结构和功能预测，为高羊茅耐热基因的研究提供依据，同时为提高草坪草水肥调控措施提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 试验材料为凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas），种子购自北京克劳沃种子公司。选择健康的草坪草种子播种在装有混合培养基质（沙子∶蛭石∶有机营养土 = 3∶1∶1）的聚乙烯花盆中。聚乙烯花盆直径为13 cm，深14 cm，每盆播种175～180粒种子。所有盆钵在室外自然光照下进行培养，气温为15～26 ℃。盆钵内的草坪草每天用自来水浇灌至盆钵底有水从小孔渗出，每周用Hoagland营养液[8]浇灌1次。20 d后将所有盆钵再转移到人工气候箱（型号：LRH-300-CS，广东省医疗器械厂生产）培养14 d，管理方式同上，人工气候箱被设置为14 h的光周期，光照强度为400 μmol·m-2·s-1， 相对湿度为（65 ± 10）%， 温度为26 ℃/15 ℃ （昼/夜，对照温度）。盆钵在人工气候箱内随机摆放并定期交换以保证每盆所受内部环境影响一致。然后将一半草坪草转入38 ℃/30 ℃（昼/夜）的培养箱中进行高温胁迫（处理植株），光照、相对湿度以及管理方式均与对照温度下光照培养箱中的一致。另一半仍旧在原条件下培养作为对照植株。在胁迫第6小时时取处理和对照的高羊茅叶片分别提取总RNA进行试验。

1.1.2 SSH文库构建试剂 RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa；RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；DL2000，条带依次为2 000，1 000，750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech。

1.2 试验仪器

PCR仪，ABI 9700型PCR扩增仪；凝胶成像系统，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度计，GeneQuant II，Pharmacia Biotech；离心机，5418型，eppendorf；PCR管，吸头，深孔板均为Axygen产品。

1.3 试验方法

1.3.1 高羊茅总RNA提取与mRNA的分离、纯化 取50～100 mg组织于液氮中研磨，加入缓冲液1 mL，然后提取组织总RNA。将总RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃处理30 min，抽提纯化RNA。用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度及纯度。

1.3.2 高羊茅SSH文库的构建 利用提取出的RNA反转录合成cDNA，随后对反转录得到的cDNA进行纯化以及cDNA RsaI酶切，将双链cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差减和接头连接，具体可参考PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书。随后进行接头连接和差减杂交，差减杂交进行两轮，并且对两轮差减杂交结果进行差减PCR。纯化PCR产物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector连接消减杂交片段。采用氯化钙二次重悬法制备大肠杆菌感受态。取出储存于-80 ℃的大肠杆菌菌株的保存菌液，37 ℃下，转速为225 r·min-1，扩大培养约至2.5～3.0 h， OD600=0.4为止。将0.1 mol·L-1CaCl2溶液用冰浴冷却，提取2 mL并轻轻重悬菌体至均匀，冰水浴30 min后，得到感受态细胞悬液；加入5 mL连接产物，并轻轻震荡混匀，在恒温振荡器上复苏培养80 min，让受体菌恢复正常生长；37 ℃在LB固体培养基平板上均匀涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培养于恒温培养箱中14～16 h，直至长出大小合适的蓝、白菌落。取白色饱满菌落置于96细胞培养板，于37 ℃下静置培养16～20 h，加入13 μL甘油（甘油经过高压蒸汽灭菌）混匀，-70 ℃保存，即可建成SSH文库。

1.3.3 高羊茅差异表达序列测序及其分析 用巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R来进行菌液PCR扩增，进一步筛选阳性克隆，选取96孔板克隆拿到生物工程（大连）有限公司去测序。应用VecScreen除去构建文库时用的载体及引物接头序列，并舍弃低质量序列。利用Blast在GenBank中寻找同源序列，并了解其基因功能。同时结合KOBAS程序进行基因功能归类以及代谢途径分析，并对功能蛋白进行分类和注释。

1.4 数据处理分析

本试验数据用Excel软件进行统计处理和表格制作；图片数据是由凝胶电泳仪产生，直接使用；另外得到数据后利用Blast程序在GeBank数据库中进行了搜索和分析。

2 结果与分析

2.1 高羊茅叶片RNA纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值可用来检测RNA纯度，1.8～2.1是正常的比值范围。各项试验对RNA纯度要求不一，即使比值略超出这个范围，所得样品也可用于一些普通试验，如RT-PCR、Northern杂交、RNA酶保护和荧光定量PCR等。高羊茅叶片RNA纯度如表1。

通过电泳检测，加样于1%的琼脂糖凝胶孔中，在紫外透射光下观察和拍照发现：28S和18S核糖体RNA条带非常亮且浓，在加样孔的看图模式下，上面一条带（28S）的密度约是下面一条带（18S）的2倍。下方有可能观察到一个更小的稍微扩散的带，是低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和18S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，这可能是由mRNA和其它异型RNA组成。在RNA制备过程中若出现DNA污染，将会出现在28S核糖体带的上面，此时最好对总RNA进行纯化。

2.2 高羊茅叶片cDNA的SMART合成

取1 μg高质量的Tester和Driver总RNA作为模板，用SMART技术合成cDNA双链，从电泳结果可以看出，条带呈弥散状，cDNA分子量主要分布在200～3 000 bp范围内（图2）。分别进行了18，21，24次循环，从电泳图中可以确定最佳的循环参数为21次，条带明显亮于其他循环次数。

2.3 高羊茅的RsaI酶切质检图

经四碱基识别的RsaI酶切之后，双链cDNA分布在100～2 000 bp。从图3可以看出，酶切后cDNA片段分布范围与酶切前相比略有下移，说明RsaI已经将双链cDNA切成小片段，这有利于接下来的接头连接和杂交。

接头连接效率对差减效率至关重要，一般通过检测基因Tubulin差减前后表达量的差异大小来衡量差减效率的高低。Tubulin引物可以产生一条大小为497 bp的片段，但中间没有RsaI酶切位点，扩增结果是单一条带。由图4可知，Tubulin3′引物与接头引物产生的条带亮度大于等于Tubulin3′和5′引物产生的条带亮度的1/4，说明接头连接效率符合要求。由于本试验所用试验材料基因信息很少，管家基因未知，因此，直接使用接头引物扩增来验证连接效率，一般如果接头引物能够扩增出来就认为成功接头（图4）。

2.5 高羊茅的差减效率检测

差减效率是文库构建中很重要的部分，高质量的差减文库必须能有效地去除高丰度的组成型表达基因，以便大大提高稀有基因在文库中出现的几率。一般利用 Tubulin 基因扩增差减前后的双链 cDNA，用两者之间 Tubulin 基因达到相同亮度时循环数的差异来衡量差减效率高低。循环差异达到10 个以上说明已经有效地去除了大量组成型表达的基因。在未知管家基因的情况下，一般也是用接头引物来做的，因为相同的基因被差减，差减后的条带范围看起来比差减前小，即认为差减合格。从本试验中可以明显看出差减后条带变窄（见图5），因此，我们认为其差减合格。

2.6 高羊茅的抑制消减文库cDNA片段大小的检测

随机挑取SSH文库中的阳性克隆至5 mL LB液体培养基中，37 ℃下摇菌过夜，模板用过夜菌液来进行菌落PCR扩增。如图6所示，插入片段大小不同，大小介于100～1 000 bp之间，还有几种位于250～750 bp之间。据有关报道，RsaI酶为四碱基识别酶，约在256 bp处有一个酶切位点，而酶切后的cDNA片段一般小于600 bp[8]，电泳结果说明所构建的SSH文库的插入片段大小符合要求。

2.7 高羊茅的EST序列分析

将3个大小约500 bp左右的EST，送往上海欧易生物有限公司测序。所得结果经过前处理、聚类和拼接，共得到100个有效序列，其中38个未知序列，其余62个为已报道序列，但是序列功能全部未知。根据NCBI数据库中的描述，这些EST中有25个与叶绿体染色体有关，其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。

对获得的EST用BlastN和BlastX工具进行序列比对。在能量和基础代谢类中，参与光合作用及叶绿体结构建成的基因最多，如1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco），Rubisco活化酶、叶绿素a/b结合蛋白等出现的频率都较高；当植株受到胁迫时，光合作用首先响应，也受到最大的伤害，可能因此与叶绿体相关的基因最多。

本次试验仅仅在阳性克隆中挑选了部分相关性可能较大的序列进行了测序，受数据量的限制，未发现已知功能的序列，如果加大测序范围，或者加大随机克隆的数量，有可能会找到已知功能的序列。差异基因的表达量和胁迫时间也有着重要关系，SSH方法只能对比胁迫的两个时间点，可能遗漏部分差异基因，因此，研究结果具有不确定性。

3 讨 论

3.1 高质量 RNA是构建高质量文库的基础

反转录前必须检测tester和driver的总RNA的质量，高质量的RNA是差减文库构建成功与否的关键因素之一。本试验在总RNA提取、纯化的每一个步骤都进行严格的检验，确保其质量满足建库的要求。检测RNA溶液的纯度方法之一是看A260/A280的比值，其范围一般是1.8～2.1。本试验中高羊茅叶片RNA溶液的A260/A280的比值在2.1左右，质量合格。试验发现28S和18S核糖体RNA条带非常亮且浓，在加样孔的看图模式下，上面一条带（28S）的密度约是下面一条带（18S）的2倍。但是存在一定的弥散现象，因此必须对总RNA进行纯化以满足试验要求。

运用SSH进行一轮差减杂交，可富集稀有序列1 000倍以上[9]，使某些低丰度表达的mRNA有望被检出。Von Stein等[10-11]的研究表明，SSH的阳性率达94%，而且与mRNA差异显示技术[12]、cDNA-AFLP[13]相比，SSH可同时分离出上百个差异表达基因。由于试验材料有限，提取的总量有限，所以在建高羊茅消减杂交进行反转录时直接进行总反转录，从本次试验所建成的文库质量以及下面的试验结果来看，用本方法可以成功地构建高羊茅热胁迫的抑制消减杂交文库。

3.2 构建高羊茅cDNA消减文库的重要性

cDNA的克隆和测序是确定在一种生物体、某一器官、某一发育阶段表达基因的核苷酸序列的快速方法。为加快这一进程，研究者往往并不首先去读取基因的全长序列，而是先从部分基因片段开始研究，为每一个基因确定一个足以成为其独特标记的片段，即表达序列标签（ESTS）[14]。ESTS通常包含能够反映该基因可能具有功能的结构信息，以及与其他基因之间相互关系的信息。本研究应用抑制性差减杂交的方法，以热胁迫和对照高羊茅叶片为材料，提取RNA并合成其相应的cDNA，再由Rsal酶切后产生一个以上的cDNA片段，最终获得了许多基因的表达序列标签[15]。这些基因片段将是笔者研究高羊茅受到热胁迫时差异性表达基因的重要线索，同时也提供了探索抗热基因响应机理的分子基础。消减杂交是构建差减cDNA文库的核心，消减文库是否构建成功，很大程度上决定于差减杂交的效率，差异基因片段的大小和重组率。从本次试验构建的文库评价指标来看，笔者已成功地获得了目标消减文库。该库的成功获得为下一步的试验提供了研究平台。

3.3 选择抑制消减杂交作为研究方法的依据

SSH技术快速有效，可以分离差异表达基因，和其它筛选差异基因的技术相比，它具有以下优点：（1）特异性好。扩增差异表达的目的cDNA片段具有选择性，抑制非目的片段扩增，可筛去那些在细胞或组织普遍表达的基因，提高了筛出率。（2）灵敏度高。利用了二级动力学原理，在退火时产生同源杂交的速度方面，丰度高的单链DNA要快于丰度低的单链DNA，使丰度上有差别的单链DNA的相对含量相同，可有效克隆出极低丰度的差异表达基因。（3）高效快速。 SSH可同时分离几十个甚至几百个差异表达基因。（4）操作简便，对仪器设备的要求不高。鉴于这些优点，笔者选择了该方法构建高羊茅热胁迫的抑制消减文库。

但SSH技术也存在一些缺点。首先，SSH 技术要求起始的mRNA量很大（>2 μg），这是一个限制性因素，提高了对来源受限的样品的要求。其次，SSH技术采用的是四碱基识别的限制性酶如RsaI来酶切，该酶在相距256 bp处存在一个酶切位点，酶切片段大小一般小于600 bp（50～1 000 bp）[16]，其优点是：适于与接头连接[17]，防止长链cDNA片段形成的复杂结构对差减杂交效率的干扰，可满足翻译产物同源性预测和同源基序筛选的要求[18]。但由于限制性酶的引入使最终获得的是片段库，而非全长cDNA文库，要获得基因的全长还要借助其他分子生物学手段，如RACE技术或筛选全长cDNA文库。

4 结 论

（1）试验最终构建了高羊茅抗热正向和反向差减文库，每个文库分别随机挑选了384个基因进行克隆。两个文库的基因片段的长度分布在200～900 bp，平均片段长度约500 bp左右。

（2）在通过抑制差减杂交构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST，测序后共得到100个有效序列，其中38个未知序列，其余62个为已报道序列，但是序列功能全部未知。根据NCBI数据库中的描述，这些EST中有25个与叶绿体染色体有关，其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。

（3）试验得到合格的差减文库，其中大量组成型表达的基因已经被有效去除，使某些特有的差异基因得到了富集。这可为后续的高羊茅耐热基因的研究提供依据，同时也为提高草坪草水肥调控措施提供理论基础。

参考文献：

[1] 潘美辉，金虎林，袁建刚，等. 基因差异表达的研究方法[J]. 基础医学与临床，1997， 17 （5）： 1-10.

[2] 李广存， 金黎平， 谢开云，等. 抑制差减杂交（SSH）技术及其在植物基因分离上的应用[J]. 中国生物工程杂志， 2004， 24（9）： 26-32.

[3] 谢永丽，王自章，刘强，等.草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB的克隆及功能鉴定[J]. 中国生物化学与分子生物学报， 2005， 21（4）： 521-527.

[4] 谢永丽，王自章.草坪草狗牙根中cyclinD基因片段的分离[J].青海大学学报：自然科学版， 2006，24（5）： 30-33.

[5] Tian J， Belanger F C， Huang B R. Identification of heat stress-responsive genes in heat-adapted thermal Agrostisscabra by suppression subtractive hybridization[J]. Plant Physiology，2009， 166（6）： 588-601.

[6] Xu J， Belanger F， Huang B R. Differential gene expression in shoots and roots under heat stress for a geothermal and non-thermal Agrostis grass species contrasting in heat tolerance [J].Environ Exp Bot，2008， 63（1）： 240-247.

[7] Xu J， Tian J， Belanger F， et al.Identification and characterization of an expansin gene AsEXP1 associated with heat tolerance in C-3 Agrostis grass species[J]. Exp Bot， 2007，58（13）：3 789-3 796.

[8] 苏红英，张鹏飞. 抑制性消减杂交技术研究进展[J].福建医科大学学报，2004，38（3）：354-357.

[9] Kim J Y， Chung Y S， Paek K H， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding the cysteine proteinase inhibitor， induced upon flower maturation in carnation using suppression subtractive hybridization[J]. Mol Cells， 1999， 9（4）： 392-397.

[10] Von Stein O D， Thies W G， Hofmann M. A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（13）： 2 598-2 602.

[11] Zanders E D， Goulden M G， Kennedy T C， et al. Analysis of immune system gene expression in small rheumatoid arthritis biopsies using a combination of subtractive hybridization and high-density cDNA arrays[J]. Journal of Immunological Methods， 2000， 233（1）： 131-140.

[12] Diatachenko L， Lau Y F C， Campbell A P， et al. Suppression subtractive hybridization： A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Pro Natl Acad Sci USA， 1996， 93： 6 025-6 030.

[13] Qin L， Overmars H， Helder J， et al. An efficient cDNA-aFLP-based strategy for the identification of putative pathogenicity factors from the potato cyst nematode globodera rostochiensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13（8）： 830-836.

[14] 王艳，李建龙，潘永年，等.草坪草转基因育种研究进展[J].草原与草坪，2007，123（4）：13-17.

[15] 邓蕾，王艳，李建龙.高温胁迫下不同激素处理对高羊茅生理生态指标及耐热性的影响[J].草原与草坪，2010，30（3）：33-37.

[16] Yang G P， Ross D T， Kuang W W， et al. Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes[J]. Nucleic Acids Res， 1999， 27（6）： 1 517-1 523.

[17] Girard J P， Baekkevold E S， Yamanaka T， et al. Heterogeneity of endothelial cells： The specialized phenotype of human high endothelial venules characterized by suppression subtractive hybridization[J]. Am J Pathol， 1999， 155： 2 043-2 055.

[18] Tchernitsa O I， Zuber J， Sers C， et al. Gene expression profiling of fibroblasts resistant toward oncogene-mediated transformation reveals preferential transcription of negative growth regulators[J]. Oncogene， 1999， 18（39）： 5 448-5 454.

[7] Xu J， Tian J， Belanger F， et al.Identification and characterization of an expansin gene AsEXP1 associated with heat tolerance in C-3 Agrostis grass species[J]. Exp Bot， 2007，58（13）：3 789-3 796.

[8] 苏红英，张鹏飞. 抑制性消减杂交技术研究进展[J].福建医科大学学报，2004，38（3）：354-357.

[9] Kim J Y， Chung Y S， Paek K H， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding the cysteine proteinase inhibitor， induced upon flower maturation in carnation using suppression subtractive hybridization[J]. Mol Cells， 1999， 9（4）： 392-397.

[10] Von Stein O D， Thies W G， Hofmann M. A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（13）： 2 598-2 602.

[11] Zanders E D， Goulden M G， Kennedy T C， et al. Analysis of immune system gene expression in small rheumatoid arthritis biopsies using a combination of subtractive hybridization and high-density cDNA arrays[J]. Journal of Immunological Methods， 2000， 233（1）： 131-140.

[12] Diatachenko L， Lau Y F C， Campbell A P， et al. Suppression subtractive hybridization： A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Pro Natl Acad Sci USA， 1996， 93： 6 025-6 030.

[13] Qin L， Overmars H， Helder J， et al. An efficient cDNA-aFLP-based strategy for the identification of putative pathogenicity factors from the potato cyst nematode globodera rostochiensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13（8）： 830-836.

[14] 王艳，李建龙，潘永年，等.草坪草转基因育种研究进展[J].草原与草坪，2007，123（4）：13-17.

[15] 邓蕾，王艳，李建龙.高温胁迫下不同激素处理对高羊茅生理生态指标及耐热性的影响[J].草原与草坪，2010，30（3）：33-37.

[16] Yang G P， Ross D T， Kuang W W， et al. Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes[J]. Nucleic Acids Res， 1999， 27（6）： 1 517-1 523.

[17] Girard J P， Baekkevold E S， Yamanaka T， et al. Heterogeneity of endothelial cells： The specialized phenotype of human high endothelial venules characterized by suppression subtractive hybridization[J]. Am J Pathol， 1999， 155： 2 043-2 055.

[18] Tchernitsa O I， Zuber J， Sers C， et al. Gene expression profiling of fibroblasts resistant toward oncogene-mediated transformation reveals preferential transcription of negative growth regulators[J]. Oncogene， 1999， 18（39）： 5 448-5 454.

[7] Xu J， Tian J， Belanger F， et al.Identification and characterization of an expansin gene AsEXP1 associated with heat tolerance in C-3 Agrostis grass species[J]. Exp Bot， 2007，58（13）：3 789-3 796.

[8] 苏红英，张鹏飞. 抑制性消减杂交技术研究进展[J].福建医科大学学报，2004，38（3）：354-357.

[9] Kim J Y， Chung Y S， Paek K H， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding the cysteine proteinase inhibitor， induced upon flower maturation in carnation using suppression subtractive hybridization[J]. Mol Cells， 1999， 9（4）： 392-397.

[10] Von Stein O D， Thies W G， Hofmann M. A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（13）： 2 598-2 602.

[11] Zanders E D， Goulden M G， Kennedy T C， et al. Analysis of immune system gene expression in small rheumatoid arthritis biopsies using a combination of subtractive hybridization and high-density cDNA arrays[J]. Journal of Immunological Methods， 2000， 233（1）： 131-140.

[12] Diatachenko L， Lau Y F C， Campbell A P， et al. Suppression subtractive hybridization： A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J]. Pro Natl Acad Sci USA， 1996， 93： 6 025-6 030.

[13] Qin L， Overmars H， Helder J， et al. An efficient cDNA-aFLP-based strategy for the identification of putative pathogenicity factors from the potato cyst nematode globodera rostochiensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13（8）： 830-836.

[14] 王艳，李建龙，潘永年，等.草坪草转基因育种研究进展[J].草原与草坪，2007，123（4）：13-17.

[15] 邓蕾，王艳，李建龙.高温胁迫下不同激素处理对高羊茅生理生态指标及耐热性的影响[J].草原与草坪，2010，30（3）：33-37.

[16] Yang G P， Ross D T， Kuang W W， et al. Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes[J]. Nucleic Acids Res， 1999， 27（6）： 1 517-1 523.

[17] Girard J P， Baekkevold E S， Yamanaka T， et al. Heterogeneity of endothelial cells： The specialized phenotype of human high endothelial venules characterized by suppression subtractive hybridization[J]. Am J Pathol， 1999， 155： 2 043-2 055.

[18] Tchernitsa O I， Zuber J， Sers C， et al. Gene expression profiling of fibroblasts resistant toward oncogene-mediated transformation reveals preferential transcription of negative growth regulators[J]. Oncogene， 1999， 18（39）： 5 448-5 454.