石榴酒酿造过程中的多酚及其抗氧化性

李明月　郝雅兰　樊明涛　陈婧婕　徐广令

摘 要：使用福林酚法测定石榴酒的总酚含量，以还原能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力及羟基清除能力为抗氧化指标，对石榴酒酿造过程中多酚含量及抗氧化能力进行分析。结果表明，在酿造过程中，石榴酒总酚、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力及羟基清除能力在酿造过程中稍微有所下降， 但最终趋于稳定并维持在较高水平， 还原能力则始终保持恒定，与原汁相比无明显损失。石榴酒作为一种新型养生果酒，其多酚含量较高， 表现出较强的抗氧化能力。同时，本试验中所选的3种酿酒酵母在酿造过程中对石榴酒的抗氧化能力的影响彼此之间无显著差异。

关键词：石榴酒；多酚；抗氧化性

中图分类号：TS262.7 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.005

石榴自古以来就有“水晶珠玉”之称，被列为果中珍品，在我国各地广泛分布。其风味独特且功能性成分含量很高，有生津化食，健脾益胃，降压止泻，驱除肠道寄生虫等保健疗效作用[1]。国内多次报道：食用石榴有预防高血压功效，石榴对流感病毒也有抑制作用[2]。然而，我国对于石榴产品的开发还不是很成熟，加工品种单调，长期以来均以鲜食为主。在石榴汁的榨取过程中，会由于石榴籽中苦味物质的释放而影响其风味，但在石榴酒的酿造过程中可以经果胶酶的作用解决这一问题。然而，现阶段对石榴酒酿造过程中功能性成分变化的研究却很少。通过对石榴酒的酿造过程中功能性成分例如多酚的变化进行系统研究，探讨多酚类化合物的变化规律，可为进一步提升石榴的营养价值奠定良好的理论依据，也可促使扩大石榴酒的生产，将石榴资源的地方优势变为经济优势。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

石榴原料：采用产于四川省德阳市石榴示范基地的红皮突尼斯软籽甜石榴。

酿酒酵母：1#（WLP775），2#（4766 cider），3#（EXCE-SP）。

仪器：HC-3018R 高速冷冻离心机（安徽中科中信科学仪器有限公司），3802-uv/vis 紫外分光光度计（尤尼柯仪器有限公司），HS-840μ 型水平层流单人净化工作台（苏州净化设备有限公司），PHS-3S pH 计（上海精科仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 石榴酒酿造工艺 参考文献[3-4] 中的方法。挑选石榴→剥壳→去皮去隔膜→果汁处理（60 mg·L-1SO2， 250 mg·L-1果胶酶）→装罐（SO2熏罐）→接种（4%酵母）→ 酵母发酵→倒罐→灭菌→成品。

1.2.2 常用指标测定 可溶性固形物采用手持折光仪测定；酒精含量采用酒精比重计法[5]测定；pH值采用pH计法测定；总酸采用酸碱指示剂法测定；还原糖采用DNS法[6-7]测定。

1.2.3 多酚的测定 总酚采用Folin-Ciocaheus 法[8]测定，取稀释50倍的酒样1.0 mL，依次加入5 mL蒸馏水、1 mL FC显色剂、3 mL质量分数为7.5%碳酸钠溶液，于避光处静置2 h后，于765 nm波长下测定样品的吸光度。根据不同浓度梯度的一水没食子酸溶液吸光度所绘制的标准曲线，计算总酚的含量。

1.2.4 抗氧化活性的测定 参考文献[9-10]中的方法。（1）还原能力的测定：取0.2 mL酒样，依次加入1 mL蒸馏水、浓度为0.2 mol·L-1pH值为6.6的磷酸缓冲液2.5 mL、质量分数1%的铁氰化钾2.5 mL。将混合溶液置于50 ℃保温箱中，恒温20 min后加入质量分数为10%的三氯乙酸1 mL、蒸馏水2.5 mL、质量分数为0.1%的三氯化铁0.5 mL，于700 nm下测定吸光度。以混合溶液的吸光度计算试样的还原能力，则吸光度越高还原能力越强。

（2）DPPH 自由基清除率的测定：取200 μL酒样加入1 800 μL蒸馏水、浓度为0.1 mmol·L-1的DPPH自由基醇2 mL，静置30 min后，于517 nm下测定吸光度。吸光度越小，则自由基清除能力越强。

计算公式：DPPH自由基清除率=（1-A1/A0）×100%

式中：A1为石榴酒酒样吸光度；A0为空白组吸光度。

（3）超氧阴离子清除率的测定：取50 mmol·L-1 Tris-HCl 缓冲液（pH值8.2） 4.5 mL，加入1 mL酒样、25 mmol/L 的邻苯三酚0.4 mL，静置25 min。加入8 mmol·L-1 HCl 1 mL以终止反应，后于299 nm下测定吸光度。空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品。

计算公式：超氧阴离子清除率=[Ao-（Ax-Axo）]/Ao×100%

式中：Ax为石榴酒酒样吸光度；Ao为以水代替样品做空白对照；Axo为样品液本底水代替邻苯三酚。

（4）羟基自由基清除率的测定：将1 mL 9 mmol·L-1的FeSO4、1 mL 9 mmol·L-1水杨酸乙醇混合，后加入1 mL酒样（以Ao做空白对照，用水代替样品），加入1 mL 8.8 mmol·L-1的H2O2启动反应。置于37 ℃下反应30 min，于510 nm下测定吸光度。

计算公式：羟基自由基清除率=[Ao-（Ax-Axo）]/Ao×100%

式中：Ax为石榴酒酒样吸光度；Ao为以水代替样品做空白对照；Axo为本底反应以水代替H2O2。

2 结果与分析

2.1 原料四川甜石榴基本理化指标分析

原料红皮突尼斯软籽甜石榴原液中可溶性固形物含量约为14.1 Brix，总酸4.52 g·L-1（以酒石酸计），pH值3.73。主发酵结束后，可溶性固形物含量下降到5 Brix，总酸稍微有所上升，含量为5.25～5.43 g·L-1，成品酒的酒精度为4%vol～5%vol，本发酵过程没有另外添加糖，属于原汁发酵的低度果酒，最终pH值范围为3.78～3.79，几乎和原汁相同，比葡萄酒的pH值要高一些。

2.2 总酚变化

石榴多酚是一类强抗氧化剂，有助于改善关节弹力和皮肤弹性，强化动脉、静脉和毛细血管[11-12]，其对抗关节炎和运动伤害的炎症功效也有所报导[13-14]。因此，在石榴酒的酿造过程中对多酚含量的变化进行研究，有助于改善石榴酒品质。

以没食子酸作为标准物得到的多酚的标准曲线为：

Y=0.011 8X+0.012 0 （R2=0.999 3），

决定系数R2大，说明该关系式线性良好。利用该关系式计算石榴酒样品的多酚含量，获得石榴酒在发酵过程中随时间变化的关系（图1）。

由图1可以看出，对于不同种类的酵母，在石榴酒的酿造过程中总酚的含量在前两天均有一定的下降，随后逐渐趋于平稳。在石榴酒酿造初期，石榴汁中含有较多的氧，多酚自身分解及氧化，导致含量降低。随着氧被耗尽，多酚含量趋于稳定，而与所用酵母种类关系不大，且最终仍稳定于较高的水平。

2.3 还原能力

由于酒样中的抗氧化剂能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁（亚铁氰化钾），二价铁进一步和三氯化铁反应生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝（Fe4[Fe（CN）6]3 ），因此，测定700 nm处的高低可以间接反映抗氧化剂的还原能力大小，吸光度越大，还原能力越强。

由图2可以得知，石榴酒在酿造过程中，还原能力没有太大的变化，始终维持在一个较高的水平，而所用酵母对石榴酒的还原能力基本没有影响。天然化合物的还原能力可以反映其抗氧化性，石榴酒与其他果酒相比有较强的还原能力[15]。

2.4 DPPH清除能力

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在波长为517 nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力[16-17]。

由图3可以得知，对于不同种类的酵母，在石榴酒的酿造过程中DPPH清除率在前两天均有一定的下降，随后稍有上升趋势。在石榴酒酿造初期，石榴汁中含有较多的氧，导致其DPPH清除率降低，随后随着氧气耗尽，DPPH清除率基本维持在一个较高的水平。不同种类酵母对此项指标影响不大，最终其DPPH清除率稳定在92%左右，与原汁相差很小。

2.5 超氧阴离子清除能力

利用邻苯三酚在弱碱性介质中会自身氧化分解产生有色中间物和O2·-，O2·-对自氧化又起催化作用，此有色物质在299 nm处有最大吸收波长，依据有色中间物的生成量，判断O2·-的生成量。若体系中加入清除O2·-的物质，则会减少有色物质的生成，吸光度降低。吸光度越低，清除O2·-的效果越好。

由图4可以得知，在石榴酒酿造的初期，其超氧阴离子清除能力呈现降低的趋势，但最终稳定在70%左右，所用酵母种类对最终结果没有显著影响。在酿造初期，由于石榴汁中含有一定量的氧，而使其超氧阴离子清除能力下降，但最终仍稳定在高于其他果酒的较高水平上[18]。

2.6 羟基自由基清除能力

羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以使细胞坏死或突变，羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关[19]。羟基自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，在羟基自由基体系中加入水杨酸， 用比色法测定其羟基化产物2，3—二羟基苯甲酸的含量，进而判断样品的羟基自由基清除能力。

由图5可以得知，对于不同种类的酵母，在酿造前两天羟基自由基清除率均呈上升趋势，后趋于稳定，最终均稳定在98%左右，所用酵母种类对其影响很小。在酿造初期，由于酵母发酵果渣中抗氧化性物质溶解，而使其羟基自由基清除能力上升，但最终趋于稳定。

3 结 论

本试验研究了石榴酒酿造过程中多酚含量的变化，并且对石榴酒抗氧化性进行了测定。不同种类酵母对石榴酒发酵过程中功能性成分的变化几乎无影响，且与原汁基本相同。石榴酒在酿造过程中其多酚的损失量较小，保留了绝大多数的多酚，这对食用者的身体是有好处的。石榴酒的还原能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力及羟基清除能力等抗氧化指标，在酿造初期虽有所降低，但最终均保持在较高水平，说明石榴酒是一个抗氧化能力比较强的产品。开发石榴酒不仅填补了果酒市场的空缺， 对人们的身体健康也有极大的好处，是一种值得推广的新型养生果酒。同时开发利用石榴酒，还极大地延长了石榴的产业链，为当地经济发展做贡献。

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